 |
Методы выделения и очистки целевых продуктов в процессе культивирования микроорганизмов
|
|
|
|
НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
В.К. Османов
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ
ПРОДУКТОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ
ПРОИЗВОДСТВ
Учебно-методическое пособие
Нижний Новгород
Издательство НижГМА
УДК 615.014У79
ББК
Авторы:
доцент кафедры управления и экономики фармации и фармацевтической технологии НижГМА, д.х.н. В.К.Османов
Рецензенты:
Рекомендовано Центральным методическим советом НижГМА
(протокол № от
Османов В.К.
Методы выделения и очистки продуктов биотехнологических производств: учебно-методическое пособие / В.К. Османов. - Н. Новгород: Изд-во Нижегородской гос. медицинской академии, 2014. - с.
ISBN
Рассмотрены основные методы выделения и очистки продуктов биотехнологичеких производств. Основное внимание уделено особенностям выделения, очистки и сушки лекарственных продуктов белковой природы.
Издание предназначено для студентов фармацевтических факультетов вузов по специальности 060301 «фармация», дисциплине «биотехнология».
УДК
ББК
Османов В.К.
Нижегородская государственная
ISBN медицинская академия, 2014
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение.................................................................................................5
Методы выделения и очистки целевых продуктов
в процессе культивирования................................................................6
Основы технологии выделения, концентрирования
и очистки белковых и ферментных препаратов................................12
Основы технологии сушки белковых и ферментных
препаратов..............................................................................................20
Лиофильная сушка..…...................................................................... …21
Стандартизация и номенклатура ферментных препаратов….........24
|
|
|
Типовые примеры выделения и очистки ферментных
препаратов..............................................................................................26
Рекомендуемая литература...................................................................28
Вопросы для самоконтроля..................................................................29
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
масс.% – массовые проценты
атм. - атмосфера
рН - водородный показатель
КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза
ДЭАЭ - диэтиламиноэтилцеллюлоза
мм рт. ст. - милиметр ртутного столба
1 кат - катал — единица активности фермента
М - молярность раствора
Пх - ферментный препарат, полученным методом поверхностного культивирования
Гх - ферментный препарат, полученным методом глубинного культивирования
ВВЕДЕНИЕ
Биотехнология - стремительно развивающаяся и интегрирующая дисциплина, пронизывающая все биологические науки и направления исследований. Современная биотехнология - это междисциплинарная наука и отрасль производства, которая базируется на использовании биологических объектов и систем при получении пищевых продуктов, энергии, медицинских препаратов; при очистке сточных вод, переработке отходов и др. Междисциплинарная природа биотехнологии выражается в ее связи с такими науками, как генетика, микробиология, биохимическая и химическая технология и механика систем и аппаратов катализа. На развитие биотехнологии существенное влияние оказывают открытия в самых разных областях человеческой деятельности — биологии, физики, химии, материаловедение.
Использование современных продуктов биотехнологии требует выделения, очистки и контроля их качества. Во многих промышленно значимых процессах, львиную долю стоимости производства зачастую составляет не затраты на культивирование продуцентов, а последующие процессы выделения и очистки продукта (постферментация). Стоимость очистки тем выше, чем ниже концентрация вещества в клетках. Это особенно важно в случае фармацевтических препаратов, требующих высокой степени чистоты. Получение продуктов биотехнологии в настоящее время невозможно без использования знаний о их структуре и физико-химических свойствах, позволяющих определить оптимальный метод их выделения и очистки. Целью настоящего учебного пособия является ознакомление студентов с основными методами отделения биомассы клеток от культуральной жидкости, особенностями выделения и очистки и сушкицелевых продуктов, методами переработки биомассы и культуральной среды.
|
|
|
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ В ПРОЦЕССЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Завершающей стадией любого микробиологического производства является выделение целевого продукта из культуральной среды и его очистка. Таким целевым продуктом может быть либо биомасса клеток, либо какой-то продукт клеточного метаболизма. Если целевой продукт-метаболит находится внутри клетки (накапливается или входит в состав клеточных структур и оболочки), то он является эндометаболитом, если выделяется клеткой в культуральную жидкость - экзометаболитом.
В большинстве случаев извлечения эндометаболитов необходимо предварительное разрушение клеток. Однако этот процесс удобнее проводить не непосредственно в культуральной среде, извлекаемой из реактора-ферментера, а с концентратом клеток после удаления культуральной жидкости. Поэтому первым этапом выделения большинства продуктов микробиологического синтеза является отделение биомассы микроорганизмов продуцентов от культуральной жидкости. При этом в зависимости от типа используемых микроорганизмов могут применяться самые различные методы.
Для отделения самых мелких по размеру бактериальных клеток использование обычных фильтров, работающих под действием силы тяжести фильтруемой жидкости, невозможно. Для этого используются специальные устройства - вакуум-фильтры и нутч-фильтры, в которых процесс фильтрования ускоряется за счет принудительного увеличения разности давлений над и под фильтрующей перегородкой. В нутч-фильтре (рис.1) избыточное давление создается над слоем фильтруемой жидкости. У вакуум-фильтров (рис.2 - барабанный, рис.3 - ленточный) перепад давлений возникает за счет создания пониженного давления под фильтрующей поверхностью. Фильтрование бактериальных суспензий - процесс очень медленный и сопряжен с большими трудностями, которые обусловлены малым размером клеток и, как следствие, еще меньшим размером пор фильтра, высокой вязкостью суспензий и наличием большого количества примесей микрочастиц различной природы. Поэтому стадии фильтрования обычно предшествует предварительная обработка суспензий с целью максимально возможной коагуляции клеток и примесей в более крупные и легко фильтруемые частицы. Применяются несколько видов коагуляции: тепловая, органическими и неорганическими кислотами, неорганическими солевыми электролитами (Na2SiO3, Na2HPO4), которые взаимодействуют с ионами Са2+, находящимися в культуральной жидкости, с образованием труднорастворимых соединений. Образующиеся частицы осадка захватывают клетки микроорганизмов и примеси.
|
|
|
Ca2+ + Na2SiO3 = CaSiO3 + 2Na+
Ca2+ + Na2HPO4 = CaHPO4 + 2Na+
Процесс коагуляции улучшается при использовании комбинированных методов, таких, как кислотная и тепловая, электролитная и тепловая коагуляция. Эффективным методом коагуляции суспензий является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами - флокулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флоккулы, или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.
Образующиеся в результате коагуляции и флокуляции крупные частицы перед фильтрованием могут быть подвергнуты процессу седиментации (осаждению под действием силы тяжести) с последующей декантацией -сливом надосадочной жидкости, которая далее может быть дополнительно очищена фильтрованием.
Осадки большинства микробных клеток относятся к разряду сжимаемых, то есть уплотняющихся, поэтому со временем скорость фильтрации будет заметно уменьшаться. Для облегчения фильтрации микробных суспензий и уменьшения перепадов в скоростях фильтрации используют барабанный или ленточный фильтр с намывным слоем - аппарат полунепрерывного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность наносят специальный дренажный слой, представляющий собой порошок диатомита, фильтрперлита (размолотые вулканические породы, содержащие SiO2 и Al2O3) или древесной муки. В процессе фильтрования клетки оседают на этот слой. Особенность работы такого фильтра (в отличие от обычного вакуум-барабанного или ленточного) состоит в том, что нож, предназначенный для съема осадка с барабана, имеет специальную регулируемую микрометрическую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру, срезая нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа, обновляя, таким образом, фильтрующую поверхность поэтому скорость фильтрации не снижается.
|
|
|
Для предварительного концентрирования (сгущения) более крупных и тяжелых клеток дрожжей и микрогрибов широко используют флотацию. Основной движущей силой флотации являются всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы клетки. Процесс проводят в специальных аппаратах - флотаторах, в которых нагнетают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят и выводят сконцентрированную в 4-6 раз суспензию клеток (получение пекарских дрожжей).
Для последующего концентрирования и отделения биомассы грибов и дрожжей используют сепарирование (одноступенчатое или многоступенчатое)
для разделения суспензий и эмульсий, а так же центрифугирование для отделения твердых осадков и клеток от культуральной жидкости (рис. 4, 5). Так для сгущения суспензии дрожжей от 20-30 г/л до 550-600г/л с помощью сепаратора-сгустителя непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501 К-3, необходимо последовательное сепарирование в 2-3 ступени. С помощью центрифуг различных конструкций удается отделять из культуральных жидкостей бактерии, дрожжи, грибы. Наличие в культуральной жидкости высоковязких компонентов, таких как различные экзополисахариды типа декстрана, аубазидана, пуллулана и др. существенно затрудняет процесс центрифугирования.
Для извлечения целевых продуктов эндометаболитов из концентрата микробной биомассы ее либо обрабатывают каким-либо экстрагентом без разрушения клеток (экстракция петролейным эфиром биожира из кормовой биомассы дрожжей, извлечение полиеновых антибиотиков), либо клетки разрушают каким-либо из методов, а затем экстрагируют продукты.
|
|
|
Для разрушения (дезинтеграции) клеток применяют целый набор методов, которые можно отнести к трем основным группам: физико - механические, химические и энзиматические (ферментные) методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в то же время достаточно мягкими, чтобы исключить денатурацию или разрушение целевого продукта. А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из различных полимеров (иногда сопоставимых или превосходящих по прочности лучшие сорта сталей), то никакого универсального метода их разрушения не существует. Еще одним фактором, обеспечивающим прочность клеточной стенки, является клеточный тургор - напряжённое состояние клеточной оболочки, создаваемое гидростатическим давлением внутриклеточной жидкости. В клетках внутреннее давление на клеточную стенку всегда значительно превышает давление на неё наружного раствора. У большинства растений тургорное давление лежит в пределах 5-10 атм, у галофитов, грибов - 50-100 атм. Таким образом любая клетка похожа на упругий резиновый мяч, и это значительно повышает ее устойчивость к механическим нагрузкам.
К физическим методам относятся: механическое разрушение клеток путем их растирания с применением кварцевого песка или в дисковой мельнице, дробление замороженных в жидком азоте или в сухом льде клеток; экструдирование (продавливание) клеток под высоким давлением (2-5 атм.) через узкую щель или отверстие; газодекомпрессионная дезинтеграция, основанная на создании в камере с разрушаемым материалом высокого давления и быстрым сбросом его, приводящим к разрыву клеточных стенок; ультразвуковая дезинтеграция.
Энзиматические методы основаны на применении литических ферментов, разрушающих клеточную стенку: лизоцима, выделяемого из белка куриных яиц и разрушающего главным образом оболочки бактериальных клеток; ферментного комплекса, содержащегося в желудочном соке улитки Helix pomatia или продуцируемого некоторыми видами актиномицетов, лизирующего оболочки эукариотических клеток, в частности грибов. Для разрушения клеточных стенок растений используют комплекс целюлолитических ферментов.
Химические методы дезинтеграции основаны на гидролизе клеточной оболочки под воздействием водных растворов щелочей, кислот, а так же под воздействием различных детергентов (моющие средства разрушающие липидные слои клеточной стенки), ингибиторов синтеза оболочки клетки (некоторые антибиотики).
Выбор метода дезинтеграции определяется целью работы: для получения внутриклеточных ферментов наиболее приемлемы физико-механические способы; энзиматические методы широко применяют в научных исследованиях для выделения в целости различных субклеточных структур (органелл, мембран и т.д.), а так же для получения протопластов. Применение химических методов дезинтеграции микроорганизмов ведет к разрушению целостности клеточных структур, инактивации ферментов и гидролизу многих продуктов. Поэтому химические методы обычно применяют для получения пищевого белка и биожира из дрожжей.
В результате обработки клеточной биомассы по одному из методов дезинтеграции получают гомогенат, содержащий неразрушенные клетки, оболочки разрушенных клеток, обрывки мембран, различные клеточные структуры, которые могут быть отделены путем фильтрования. При этом большая часть веществ-эндометаболитов переходит в культуральную жидкость или раствор экстрагента.
Дальнейшее выделение и очистка целевых продуктов из культуральной жидкости или экстрактов зависит от их химической и физической природы.
Для извлечения таких соединений, как спирты, карбонильные соединения, кислоты, их производные, большинство антибиотиков, витаминов, алкалоидов, применяют обычные приемы и методы, используемые в химической технологии (перегонку, выпаривание, экстракцию, перекристаллизацию, возгонку и др.). В качестве примера приведем технологию экстракционного выделения бензилпенициллина из культуральной жидкости.
Современное производство бензилпенициллина включает в себя стадию глубинного культивирования микроорганизма-продуцента с последующим извлечением целевого продукта из культуральной жидкости.
На первом этапе мицелий отфильтровывается от культуральной жидкости (обычно на барабанных вакуум-фильтрах непрерывного действия). Фильтрат культуральной жидкости (нативный раствор) затем подвергается предварительной обработке (дополнительная фильтрация с применением активированного угля).
Выделение пенициллина из нативного раствора основано на способности пенициллина в виде кислоты растворяться в бутилацетате, в воде он нерастворим. Калиевая соль пенициллина, напротив, хорошо растворима в воде и нерастворима в бутилацетате. В производстве после передачи нативного раствора цеху химической очистки в сборник нативного раствора перед началом экстракции добавляют 0.03-0.06 масс.% дезэмульгатора (авироль) для лучшего разделения эмульсии.
Нативный раствор из сборника подают в эмульгатор, куда одновременно подается 9-12% раствор H2SO4 и охлажденный бутилацетат. В эмульгаторе происходит смешивание всех трех компонентов и экстрагирование бензилпенициллина (кислоты) бутилацетатом. Температуру процесса поддерживают в пределах 10-12 0 С, рН среды – 2,8 ± 3,0. При таком значении рН резко уменьшается степень диссоциации карбоксильных групп молекул бензил-пенициллина, в недиссоциированном состоянии они переходят в органическую фазу (бутилацетат). Более сильные кислоты и другие электролиты находятся в диссоциированном состоянии и поэтому не растворяются в бутилацетате; в водной фазе остаются почти все минеральные компоненты, аминокислоты, водорастворимые белки. Затем эмульсия поступает в экстрактор, где дополнительно обрабатывается бутилацетатом.
Далее бутилацетатный экстракт последовательно отмывают обессоленной водой и подвергают двухступенчатой экстракции водным раствором бикарбоната натрия NaHCO3 при рН = 7,3 -7,8. При этих условиях пенициллин находится в диссоциированном состоянии и хорошо растворяется в водной фазе и практически не растворим в бутилацетате. На данной стадии удается, очистится от примесей (в основном органических), являющихся более слабыми кислотами, чем бензилпенициллин.
Из бикарбонатного экстракта антибиотик вторично экстрагируют бутилацетатом при рН = 2,2 – 2,5.
Полученный вторичный бутилацетатный экстракт осветляют обработкой с активированным углем, далее вымораживают при -5°С в течение 20-30 минут, отфильтровывают от кусочков льда и кристалликов сульфата натрия, обезвоживая, таким образом, бутилацетатный экстракт.
Выделение калиевой соли бензилпенициллина из бутилацетатного экстракта проводят путем добавления к нему рассчитанного количества насыщенного раствора ацетата калия (раствор ацетата калия готовят в отдельном аппарате).
Полученную калиевую соль дополнительно очищают перекристаллизацией из водно-бутанольного раствора, полученные кристаллы отфильтровывают, промывают безводным бутанолом и сушат.
Наибольшую сложность представляет выделение продуктов белковой природы: ферментных препаратов, белковых антител, вакцин, гормонов и других физиологически активных веществ. Поэтому рассмотрим подробнее особенности их выделения и очистки на примере получения ферментных препаратов.
|
|
|
