Основы технологии выделения, концентрирования и очистки белковых и ферментных препаратов

 

Проведение этих стадий процесса обусловлено рядом технических сложно­стей, связанных, в основном, с нестабильностью (лабильностью) белков, проявляющейся в необратимой денатурации или частичной потере ими активности под влиянием незначительных изменений внешних условий. Поэтому при выборе технологии выделения, концентрирования и очистки белковых препаратов ищут решения, позволяющие проводить эти процессы в непрерывном режиме, с высокой скоростью, в "мягких" условиях обиваться максимального обезвоживания образующихся осадков. Для уменьшения потерь продуктов применяют различные вещества-стабилизаторы, проводят процесс при оптимальном значении рН растворов, стараются обеспечить максимально возможную механизацию и автоматизацию всех процессов.

Выделение большинства белковых продуктов непосредственно из культуральной жидкости, как правило, не производят. Это связано с тем, что концентрация целевого белка в культуральной жидкости обычно мала и не превышает долей процента. Выпадающий из такого раствора белок образует плохо фильтруемые взвеси и сильно загрязнен примесями. Поэтому стадии осаждения белка из раствора предшествует стадия его концентрирования.

Для предварительного концентрирования полученных из культуральной жидкости растворов белков перед их осаждением и сушкой используют процесс вакуум-упаривания. Быстрое упаривание водного раствора при атмосферном давлении требует его нагрева до температуры 100⁰С, т.е. до температуры кипения воды, что совершенно неприемлемо для растворов белков. Поэтому процесс упаривания проводят при пониженном давлении (ниже 50 мм рт. ст.). Для большей стабильности концентрируемых белков его стараются проводить при нейтральных значениях рН раствора. Так при значениях рН раствора меньше 4,5 и больше 8,2 активность выделяемых ферментов начинает падать уже при нагревании раствора выше 35°С. При рН=6 тот же эффект наблюдается лишь при температуре выше 50°С. Установлено, что чем меньше время выпаривания, тем выше может быть температура греющего агента, а выпаривание наиболее очищенного раствора ферментов сопровождается большей потерей активности фермента. Последнее объясняется тем, что присутствующие в растворе примеси "защищают" выделяемый белок от неблагоприятных температурных воздействий.

Процесс выпаривания чаще всего проводят в пленочных или роторных выпарных аппаратах. Потеря активности фермента в таком процессе может достигать 5-20%. С целью возможного снижения этой величины к выпа­риваемому раствору добавляют белки-стабилизаторы: альбумин, казеин или осуществляют выпаривание вместе с клетками продуцента. В качестве стабилизаторов используют и такие соли, как хлориды кальция, натрия и ацетат кальция. Правильный в качественном и количественном отношении подбор стабилизаторов позволяет при минимально допустимых потерях активности ферментов увеличить скорость процесса выпаривания раствора за счет повышения температуры греющего пара.

Технически более сложно осуществить процесс вакуум-упаривания непосредственно культуральных жидкостей. По сравнению с водными экстрактами содержание сухих веществ в них в 4-5 раз ниже и составляет 2,5-3,5%. В ходе концентрирования раствора в осадок выпадают гидроксиды, сульфаты, карбонаты и фосфаты кальция, магния и других металлов. Это приводит к изменению солевого состава и рН раствора, что способствует инактивации белка.

Часто, в промышленном производстве ферментных препаратов, полученный в процессе упаривания культуральной жидкости концентрат ферментов отделяют от выпавших в осадок примесей и, не подвергая дальнейшей очистке, добавляют к нему раствор хлорида натрия, чтобы предотвратить инфицирование продукта посторонней микрофлорой. Полученный таким образом 50% раствор препарата марки Г2х разливают по емкостям в 40-50 мл и отправляют потребителю.

Другим вариантом концентрирования белковых растворов является метод вымораживания, который основан на частичном замораживании раствора белка. Поскольку температура замерзания раствора всегда ниже температуры замерзания чистого растворителя, то образующиеся кристаллы представляют собой чистую воду, а белок концентрируется в водной фазе. Затем кристаллы льда отделяют на центрифуге. Подбирая условия замораживания исходного раствора и различные добавки можно фракционировать белки по составу и значительно сконцентрировать целевой фермент.

В отличие от вакуум-выпаривания и вымораживания ультрафильтрация или обратный осмос ( фильтрованиечерез фильтры со сверхмалым размером пор ) имеет ряд очевидных преимуществ, поскольку проводится в "мягких" условиях, обеспечивающих меньший процент снижения активности фермента. Кроме того, осуществляемое концентрирование сопровождается очисткой от балластных низкомолекулярных примесей и увеличением активности фермента в 100-150 раз. Однако энергозатраты оказываются рентабельными при концентрировании раствора до содержания сухих веществ не более 30%,что связано с забиванием пор мембраны белковыми молекулами и как следствие резким снижением скорости процесса.

Процесс ультрафильтрации в режиме диализа позволяет получать высокоочищенные препараты. Для его осуществления в получаемый концентрат постоянно добавляют чистую воду. Такая пятикратная промывка позволяет в 250-300 раз повысить активность ферментного раствора, т.е. при концентрации 30% раствор содержит практически один белковый ферментный препарат.

На практике процесс ультрафильтрации проводят в циркуляционных аппаратах периодического действия. Перед подачей раствора на стадию ультра­фильтрации из него предварительно удаляют клетки продуцента и для предотвращения развития посторонней микрофлоры на поверхности мембран подвергают стерилизующей фильтрации через специальные бактериальные фильтры. В ходе проведения процесса ультрафильтрации в зависимости от свойств получаемого фермента раствор постоянно охлаждается до темпе­ратуры 4-15° С.

Недостатком метода ультрафильтрации следует считать забивание пор мембраны осадками или адсорбированными молекулами, что приводит к снижению производительности мембранного аппарата во времени. Последнее требует периодического проведения промывки материала мембраны. Для предотвращения забивания пор мембраны осадками или сорбирующимися молекулами циркуляционный насос, используемый в этих установках, должен обеспечить линейную скорость потока жидкости через мембрану около 2-5 м/с. При таких скоростях наблюдается значительное гидравлическое сопротивление. Для его снижения на практике применяют две конструкции мембранных аппаратов: трубчатые мембранные аппараты и проточные с плоскими мембранными элементами, устанавливаемыми параллельно основному потоку раствора.

Следующей операцией после концентрирования является высаждение (денатурация) белков из раствора. Если необходимо получить осадок фермента или лекарственного белка (инсулин, интерфероны, антитела и т.д.), то это может быть только обратимая денатурация, при которой происходит лишь частичное разрушение гидратной оболочки нативного белка, а все структуры белка (вторичная, третичная и четвертичная) остаются без изменений. Такой осадок белка после удаления денатурирующего агента или фактора будет способен обратно раствориться (ренатурировать) в дистиллированной воде с сохранением своих биохимических и лекарственных свойств. При несоблюдении условий, обеспечивающих обратимую денатурацию, белок денатурируется необратимо, теряя способность к растворению в воде и как следствие свои свойства и биологическую активность.

Для выделения (высаждения) белковых препаратов из растворов часто применяют процесс высаливания. Он основан на уменьшении растворимости большинства белков в солевых растворах. Для обратимого высаждения можно использовать соли щелочных металлов, ионы которых хорошо сольватируются молекулами воды. Соли тяжелых металлов для этих целей использовать нельзя, т.к. катионы тяжелых металлов необратимо связываются с белками образуя нерастворимые комплексы. На практике в производстве используют сульфаты или хлориды натрия или аммония. Хлорид натрия и сульфат аммония дешевые и хорошо растворимые реагенты. Однако они являются сильными корозионно-активными реагентами, что обусловлено наличием анионов хлора или выделением аммиака в процессе гидролиза, особенно при повышенных значениях рН раствора. Это приводит к коррозии металлических частей оборудования.

Хороший эффект высаливания достигается при использовании сульфата натрия вместо сульфата аммония. Однако из-за меньшей по сравнению с сульфатом аммония растворимостью его можно использовать при темпера­турах раствора не ниже 35-40°С. При охлаждении раствора наблюдается выпадение осадка сульфата натрия, что создает возможность его регенерации и повторного использования. Недостатком использования сульфата натрия является необходимость более высоких энергозатрат на нагревание растворов, а пребывание белков в условиях повышенных температур способствует их инактивации.

При проведении процесса высаливания большое значение имеет режим осуществления контакта соли с раствором белка. Для высаливания можно брать соль в виде тонко измельченного порошка или в виде насыщенного раствора, что гораздо удобнее технологически. Однако установлено, что наибольший эффект - минимально необходимое количество соли на 1 кг осаждаемого белка - достигается при использовании соли в виде тонко измельченного порошка. Наименьший эффект достигается при непрерывном смешении насыщенного раствора соли с раствором фермента. Это обусловлено тем, что ионы в сухой соли связывают (сольватируют) гораздо больше молекул воды, чем те же ионы в концентрированном растворе, где они уже в значительной степени сольватированы. Для достижения того же процента высаливания в последнем случае соли требуется в 1,3-1,5 раза больше.

Время образования осадков при высаливании для различных белков колеблется в пределах 0,5-12 часов. Время высаливания и необходимое для проведения процесса количество соли зависят от количества (процентного содержания) растворенных веществ. Чем их больше, тем меньшее количество воды подлежит связыванию. Так, например, для полу­чения 1 кг препарата из культуральной жидкости требуется 45-50 кг соли, а из упаренного до 30%-ной концентрации раствора - только 1,4-1,6 кг.

В получаемых таким образом осадках белка содержится 60-85% балластных веществ, в том числе 30-45% соли. Повторное использование операций растворение - высаждение дает возможность получать высокоочищенные белковые препараты для медицинских целей.

Варьируя такие параметры, как температура и рН среды, в ряде случаев, возможно, осуществить фракционное высаждение белков. Для этого в присутствии соли изменяют рН исходного раствора или температуру, добиваясь денатурации балластной фракции белка. Последние необратимо выпадают в осадок, который отделяют от маточного раствора. На последующей стадии уже выделяют целевой белковый препарат.

Довольно часто вместо соли используют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000. Он оказывает стабилизирующее воздействие на активные белки, легко отделяется от белка методом ионообменной хроматографии или ультрафильтрации.

В технологии выделения ферментов методом осаждения значительное место занимает процесс получения активных белков осаждением их с помощью органического растворителя. Действие органических растворителей основано на снижении диэлектрической проницаемости среды (раствора), которая определяет величину силы электростатического взаимодействия между молекулами растворенного белка и растворителя (воды). Устойчивость белковых растворов обусловлена толщиной гидратного слоя, окружающего молекулу белка. При разрушении этого гидратного слоя молекулы белка начнут образовывать конгломераты и выпадать в осадок. Для осуществления такого процесса необходимо использовать вещества более гидрофильные, чем осаждаемый белок. Однако эти вещества не должны изменять значение рН среды и не реагировать с функциональными группами белковых молекул. В качестве растворителей используют, в основном, этанол, метанол, изопропанол и ацетон. Варьируя тип органического растворителя, его количество, величину рН раствора можно проводить избирательное осаждение той или иной фракции белков.

В технологии процесс осаждения органическим растворителем проводят в реакторе непрерывного и периодического действия. Для снижения процента по­терь активности выделяемого фермента при смешении растворителя с водным раствором активных белков обе жидкости первоначально охлаждают до температур соответственно -5±8°С и 5±6°С. Полученную смесь, содержащую не менее 8-10% белков, тщательно перемешивают, и через 20-30 мин происходит выпадение мелких частиц белка. Процесс осаждения проводят в вертикальном цилиндрическом аппарате с коническим днищем, снабженным мешалкой и рядом штуцеров для удаления жидкой фазы. Потеря активности ферментов на этой стадии составляет около 15%, в основном, по причине длительного контакта фермента с органическим растворителем. Организация процесса по способу непрерывного осаждения при времени контакта 10-15 мин позволяет снизить потери активности фермента на 20-25%.

Полученный на этой стадии осадок отделяют на центрифуге, промывают чистым этанолом и вновь сепарируют до остаточной влажности 30-35%.

Для получения высокоочищенных белковых препаратов, полученные на стадии выделения осадки белков снова растворяют в воде и подвергают специальным видам очистки. Одним из самых распространенных методов является сорбционная чистка. Поскольку в молекуле фермента присутствуют функциональные группы, сообщающие ей кислотный или основной характер, то обычно для этой цели используют метод ионного обмена на ионитах, полученных на основе целлюлозы: катионит КМЦ (карбоксиметилцеллюлоза) и анионит ДЭАЭ (диэтиламиноэтилцеллюлоза).

В последние годы число различных ионитов сильно возросло, и для производства конкретного белкового препарата существует возможность выбрать наилучший. Среди ионитов, получивших достаточно широкое распространение, необходимо отметить такие, как обработанный крахмал, сефадексы на основе декстрана, катиониты на основе полиметакриловой кислоты, аниониты на основе поливинилового спирта и др.

Процесс проводят в насадочных колоннах, через которые пропускается раствор очищаемого белка, или в аппаратах с мешалкой. В последнем случае предполагается последующее отделение твердой фазы.

Десорбцию осуществляют элюирующими растворами, специально подобранными для каждого фермента и сорбента. Потери фермента на стадии сорбционной чистки не превышают 15%.

Для получения более высокоочищенных белков используют и другие препаративные методы. Среди них наибольшее распространение получили такие, как диализ, гельфильтрация, электрофорез, различные виды хроматографии и др.

Диализ - процесс диффузии ионов через полимерную мембрану под действием градиента концентраций. При этом за счет диффузии через мембрану удаляются соли и другие низкомолекулярные продукты, а их место в исходном растворе ферментного препарата занимают молекулы растворителя, в данном случае воды. И хотя исходный раствор фермента при этом увеличивается в объеме, но активность его возрастает в 3-4 раза.

В последние годы с развитием промышленности по производству синтетических пленок сильно возрос интерес к использованию процесса диализа в промышленном масштабе и был создан для его осуществления ряд промышленных установок.

Разновидностью процесса диализа является электродиализ. Перенос ионов через мембраны осуществляется в этом случае не за счет градиента концентраций, а под действием электрического поля.

Разделение веществ путем хроматографии основано на их неодинаковом распределении между двумя несмешивающимися фазами. Наряду с достаточно простыми, классическими методами хроматографии, такими как колоночная, тонкослойная или бумажная, в последнее время широко применяют такие высокоэффективные методы как гельфильтрация или аффинная хроматография.

Гельфильтрация (метод “молекулярных сит) - хроматографиический метод разделения, основанный на использовании высокопористых носителей со строго определенным размером пор. При этом молекулы, способные проникнуть в поры носителя, дольше задерживаются в его материале, так как проходят при этом больший путь. В качестве материалов для проведения процессов гельфильтрации используют декстраны с поперечными связями, полиакриламид, стекло, силикагель, цеолиты и др.

Аффинная хроматография – метод, основанный на способности ферментов или других белков избирательно связывать те или иные лиганды - субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффекторы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной целевой белок из множества других белков.

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители).

Преимущество аффинной хроматографии состоит в том, что с ее помощью можно в одну стадию осуществить полную очистку продукта из сложной многокомпонентной смеси (культуральной жидкости, цельных клеточных экстрактов и т. п.), тогда как другие способы требуют многоэтапной очистки и сопряжены с большими затратами труда и времени. Однако метод имеет и ряд недостатков, в частности высокая цена материалов, используемых в аффинной хроматографии (например, веществ, применяемых в качестве лигандов), а также быстрое забивание колонки пропускаемыми веществами, что позволяет использовать их только в периодическом режиме. После каждого выделения продукта колонки промывают и частицы заполняющего геля также подвергаются очистке.

Весьма эффективный метод разделения и очистки белковых и небелковых веществ основан на взаимодействии антигенов и антител. Разработанный на основании таких взаимодействий способ получил название имунно-аффинной хроматографии, который существенно повысил разрешающую способность при введении в практику использования моноклональных антител. Блестящей иллюстрацией его эффективности является высокая степень одноэтапной очистки человеческого интерферона (чистота повышается примерно в 500 раз).

Помимо аффинной хроматографии (которая иногда называется еще аффинной адсорбцией в геле) в крупномасштабных биотехнологических процессах для очистки продуктов все шире применяют аффинную преципитацию и аффинное разделение. При аффинной преципитации лиганд соединяется с растворимым носителем и, после взаимодействия с соответствующим выделяемым соединением, образующийся комплекс по мере его формирования выпадает в осадок. Иногда ускорение выпадения преципитата достигается путем добавления различных электролитов.

Аффинное разделение основано на использовании системы, состоящей из двух водорастворимых полимеров, один из которых несет специфические лиганды, а другой обладает сродством к примесным компонентам. В качестве примера можно привести разделение нуклеиновых кислот и белков. Для полимера, соединяемого с лигандом, берется полиэтиленгликоль, а другим компонентом является декстран.

Наряду с хроматографией перспективными методами разделения веществ при биотехнологических процессах являются электрофорез и его модификации. В этих методах разделяемая смесь помещается в мощное электрическое поле, обеспечивающее движение ионизированных компонентов смеси. Различие в электрофоретической подвижности позволяет пространственно разделить входящие в ее состав компоненты. Современные варианты электрофореза используют (как и хроматография) пластинки или колонки с образующими гель наполнителями (агароза, полиакриламид, сефароза, оксиапатит и др.).

Модификацией метода электрофореза является изоэлектрическая фокусировка или электрофокусировка. В этом методе раствор, насыщающий гель, содержит соединение с кислотно-основными группами. Под влиянием электрического поля кислотно-основные группы буферного соединения меняют степень ионизации, создавая тем самым градиент рН в направлении электрического поля. Электрически заряженные компоненты разделяемой смеси, нанесенной на гель, мигрируют по направлению к электроду противоположного знака. Поскольку эти компоненты передвигаются по градиенту рН, то они постепенно теряют свои заряды и в зоне, где рН соответствует изоэлектрической точке (точке электронейтральности), их движение прекращается. Каждый компонент концентрируется (фокусируется) в определенной области геля.

 

⇐ Предыдущая123Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: