 |
Частная технология антибиотиков
|
|
|
|
Пенициллины и цефалоспорины - большая группа лекарственных препаратов, имеющих определенное сродство химического строения, механизмов действия, фармакологических, клинических эффектов.
Эти препараты называют β - лактамными антибиотиками, что обусловлено наличием в их структуре общего для всей группы чётырехчленного лактамного кольца.
Все пенициллины имеют одинаковое строение основной группы, которая представлена тиазолидиновым кольцом, соединенным β - лактамным кольцом, и имеющим аминогруппу - 6-аминопеницилановая кислота(6-АПК).
R=H - 6-аминопенициллановая кислота
Различные пенициллины отличаются строением радикала молекулы боковой цепи, активностью и спектром действия. Важные, с точки зрения клинического использования, представители пенициллинов можно разделить на несколько групп:
лекарственный антибиотик ферментация производство
- обладающие наивысшей активностью в отношении грамположительных микроорганизмов и слабой в отношении грамотрицательных видов, а также гидролизуемые β - лактамазам (бензилпенициллин);
относительно резистентные к действию β -лактамаз стафилококков, но с более низкой активностью в отношении грамположительных микроорганизмов и не действующие на грамотрицательные (нафициллин, метациллин);
относительно высокоактивные против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, но разрушаемых β - лактамазами (карбенициллин, тикарциллин);
препараты с относительной кислотоустойчивостью и пригодные для.перорального применения (феноксиметилпенициллин, ампициллин, клоксациллин).
Структурное единство ядра 6-АПК существенно для проявления биологической активности молекул. При ферментативном расщеплении β - лактамного кольца бактериальными β - лактамазами (пенициллиназами) с образованием неактивной пенициллановой кислоты антибиотик лишается своих антимикробных свойств.
|
|
|
Задачей получения новых пенициллинов является разработка препаратов, устойчивых к β - лактамазам, или со сниженной способностью к индукции синтеза β - лактамаз.
Для предотвращения возникновения резистентных форм бактерий к β - лактамным антибиотикам получены липосомальыые формы этих антибиотиков (защита антибиотика происходит в результате включения β - лактама в положительно заряженные липосомы).
Комплекс антибиотик - липосома обладает рядом преимуществ:
снижается токсичность препарата за счет направленного транспорта;
повышается проникновение антибиотиков через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий;
антибиотик, включенный в липосомы, защищен от действия β - лактамаз;
повышается химическая стабильность антибиотика. [8]
Для промышленного производства антибиотика используют культуру Penicillium chrysogenum и среду, содержащую кукурузный экстракт, гидрол, лактозу и минеральные соли.
Вместо кукурузного экстракта может быть применена арахисовая мука, жмыхи, мука из хлопковых семян и другие, источники; возможность широкого использования продуктов растительного происхождения обусловлена тем, что у P. chrysogenum имеются сильные протеолитические ферменты.
В качестве углеводов часто используют сахарозу или смесь лактозы с глюкозой в соотношении 1:1. Глюкоза может снижать биосинтез антибиотика; на средах, содержащих лактозу или сахарозу (в условиях депрессии), биосинтез антибиотика идёт активнее.
Важную роль в процессе биосинтеза пенициллина играет сера, которая содержится в структуре антибиотика. В качестве источников серы используются натрия сульфат и натрия тиосульфат. Избыток ионов меди не влияет на рост гриба, но подавляет биосинтез пенициллина.
|
|
|
Эффект торможения биосинтеза снимается добавлением в среду ионов железа. Р. chrysogenum в качестве источника фосфора может использовать не только фосфаты, но и фитаты (соли инозитфосфорных кислот): этот продуцент содержит фермент, разрушающий фитин с освобождением неорганического фосфора.
Температура в период первой фазы должны быть 30°С,. во вторую фазу 20 °С, рН в период роста гриба - ниже 7,0, потребление углеводов должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, либо дробным внесением глюкозы.
Синтез того или иного пенициллина зависит от наличия специфичного вещества в среде, иначе говоря, предшественника, который микроорганизм включает в молекулу антибиотика без предварительного расщепления. Следует отметить, что предшественники биосинтеза пенициллина (фенилуксусная кислота, фенилацетамид, феноксиуксусная кислота) при определённых концентрациях и рН среды оказывают токсическое влияние на продуцента.
Фенилуксусная кислота наименее токсична. Добавление её в среду в концентрации выше 500 мкг/мл угнетает рост мицелия, особенно в первые 24 ч его развития.
Фенилуксусная кислота добавляется в концентрации от 100 до 500 мкг/мл через 24 ч развития Р. chrysogenum. При таких условиях обеспечивается наибольший выход бензилпенициллина, который через 72 ч развития может достигать 500-1000 мкг/мл. [9]
При развитии гриба без внесения предшественника образуется около 45% бензилпенициллина и около 53% пенициллина К (радикал - n-гептилпенициллин).
При добавлении к среде фенилуксусной кислоты (C6H5CH2COOH) меняется соотношение образующихся компонентов в сторону резкого увеличения бензилпенициллина, количество которого в зависимости от возраста достигает 75-99% от смеси пенициллинов.
В процессе культивирования Р. chrysogenum в среде, не содержащей фенилуксусной кислоты, в ней накапливаются серосодержащие соединения не β - лактамного характера, близкие к цистеину и метионину. Добавление в среду фенилуксусной кислоты способствует более интенсивному метаболизму серосодержащих компонентов в соединения β - лактамного характера.
При развитии продуцента пенициллинов - гриба Р. chrysogenum - на кукурузно-лактозной среде выделяют три фазы.
|
|
|
Первая фаза - рост мицелия, выход антибиотика низок. Всегда присутствующая в кукурузном экстракте молочная кислота потребляется продуцентом с максимальной скоростью, лактоза используется медленно. Потребление кислорода высокое. Усиливается азотный обмен, в результате в среде появляется аммиак и резко поднимается значение рН.
Вторая фаза - максимальное образование пенициллина, это связано с быстрым потреблением лактозы и аммонийного азота. рH среды остаётся почти без изменений, увеличение массы мицелия незначительное, потребление кислорода снижается.
Третья фаза - снижение концентрации антибиотика в среде в связи с начавшимся автолизом мицелия и выделением в результате этого процесса аммиака, что сопровождается повышением рН среды.
Процесс биосинтеза пенициллина ведётся при самом тщательном соблюдении стерильности всех операций, так как загрязнение культур посторонней микрофлорой резко снижает накопление антибиотика. Это связало с тем, что многие бактерии воздуха способны образовывать пенициллиназу. Особенно активно продуцируют этот фермент B. subtilis и В. cereus.
Одним из активных продуцентов пенициллиназы является туберкулёзная палочка (Мусоb. tuberculosis). Предположительно именно с этим свойством связана резистентность этого микроорганизма к пенициллину.
Механизм биосинтеза молекулы пенициллина представлен на схеме:
Кетоглутарат + Ацетил-КоА
↓
Гомоцитрат
↓
α-кетоадипиновая кислота
↓α- аминоадипиновая кислота (L-α-ААК)
↓← L-цистеин
L-α-ААК- L -цистеин (LL-дипептид)
↓← L-валин
L-α-ААК-L-цистеин-D-валин (LLD-трипептид)
↓
Моноциклический β-лактам
↓
Изопенициллин N (L-α-ААК-6-АПК)
↓C6H5CH2COOH
Бензилпенициллин (C6H5CH2CO-6-АПК)
Современная промышленная микробиология получает культуральные жидкости, содержащие свыше 55 тыс. ед/мл. Выделение пенициллина начинается с фильтрации или центрифугирования (отделения мицелия гриба).
Из культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде кислоты, выделяют путём экстракции неполярными органическими растворителями (амилацетатом, хлороформом, бутилацетатом, бутанолом и др.).
|
|
|
Очистку антибиотика проводят путем замены растворителей, поскольку соли пенициллина плохо растворимы в органических растворителях.
Экстрагированный пенициллин в виде кислоты переводят в водный раствор в виде соли, добавляя щёлочь. Повторяя эти операции, пенициллин концентрируют и очищают. Большинство пенициллинов производят в виде натриевых или калиевых солей. Новокаиновые и бензатиновые соли являются основой пролонгированных препаратов пенициллина для внутримышечного введения.
Большинство пенициллинов производят в виде натриевых и калиевых солей. Новокаиновые и бензокаиновые соли являются пролонгированными формами для внутримышечного введения.
В сухой кристаллической форме пенициллиновые соли достаточно стабильны при температуре 4 °С. Растворы быстро теряют активность (в течение 24 ч при температуре 20 °С), их готовят непосредственно перед введением.
Пероральные пенициллины применяют за 1 ч до или через 2 ч после приема пищи, чтобы снизить связывание компонентами пищи и кислотную инактивацию препаратов
Цефалоспорин - антибиотик из грибов рода Cepholosporium. Основным продуцентом является С. acremonium.
Впервые сообщение было сделано Джузеппе Бротцу в 1948 г. В культуральной жидкости было обнаружено несколько цефалоспоринов, основной из которых - цефалоспорин С.
На основе этого антибиотика в дальнейшем были созданы многочисленные полусинтетические цефалоспорины с ценными свойствами.
По химическому строению цефалоспорин принадлежит β -лактамным соединениям, но β-лактамное кольцо конденсировано не с пяти, а с шестичленным гетероциклом.
Цефалоспорины в отличие от пенициллинов устойчивы к β-лактамазе, подавляют развитие и грамположительных и грамотрицательных бактерий, но активность этого антибиотика ниже пенициллина.
Цефалоспорин не инактивируется пенициллиназой. Но имеется аналогичный фермент, гидролизующий β-лактамное кольцо цефалоспорина - цефалоспориназа.
В процессе развития С. acremonium наряду с цефалоспорином С синтезируется и пенициллин N. Его образование идёт тем же путём, что и образование изопенициллина N в процессе биосинтеза бензилпенициллина. Через ряд стадий из изопенициллина N образуется цефалоспорин С.
В последние годы методом смешанного (биологического и химического) синтеза удалось получить около 50 тыс. аналогов цефалоспорина.
Примерно 50 антибиотиков имеет практическое клиническое значение. Цефалоспорины традиционно делят на четыре поколения по спектру действия и антимикробной активности. [8]
|
|
|
Таблица 1. Характеристика цефлоспоринов различных поколений
| Поколение | Препараты | Спектр активности |
| I | Цефадроксил, цефазолин, цефалексин. цефалотин, цефапирин, цефрадин | Стафилококки, стрептококки, пневмококки, энтеробактерии |
| II | Цефаклор, Цефамандол, Цефоницид, Цеокситин, Цефметазол, цефотетан, цефуроксим, цефпрозил, лоракарбеф, цефподоксим | Грамотрицательные бактерии, устойчивые к действию β-лактамаз |
| III | Цефаперазон, цефотаксим, цефазидим, цефтизоксим, цефтриаксон, цефиксим, максалактам | Энтеробактерии, в т.ч. устойчивые к другим антибиотикам. Устойчивы к действию β-лактамаз, образуемых грамотрицательным бактериями |
| IV | Цефипин | Низкое сродство к β-лактамазам, быстро проникает в периплазматическое_пространство |
Стрептомицин принадлежит к группе аминогликозидных антибиотиков.
Актиномицет, синтезирующий Streptomyces griseus впервые был выделен в лаборатории микробиологии Ратжерского университета в 1943 г. С появлением стрептомицина медицина получила мощное оружие для борьбы с таким тяжёлым и достаточно щироко распространённым заболеванием, как туберкулёз. Поэтому детально разрабатывались вопросы применения стрептомицина в терапии различных инфекционных заболеваний и его промышленного производства.
Стрептомицин продуцируют ряд видов актиномицетов рода Streptomyces. Однако основным продуцентом стрептомицина признан S. griseus, способный синтезировать до 10-20 тыс. мкг/мл антибиотика. Культуры актиномицетов весьма вариабельны и каждому штамму должна соответствовать определённая среда и свой режим для развития микроорганизма. На их изменчивость влияют условия культивирования и особенно состав сред (на более богатых по составу средах наблюдается и более быстрая изменчивость).
Изменчивость продуцентов стрептомицина - результат генетической нестабильности этих микроорганизмов, обусловленный существенными перестройками ДНК, которые затрагивают многие гены, в том числе и гены биосинтеза антибиотиков и гены устойчивости к ним.
Для стабилизации признаков, связанных с антибиотикообразованием, при хранении и поддержании штамма иногда в среды добавляют антимутагены - вещества, способные стабилизировать процессы, приводящие к хромосомным перестройкам и регуляции экспрессии генов. Среди антимутагенов - пуриновые нуклеотиды, ионы марганца, L-метионин, гистидин, полиамины, кофеин и другие соединения. В контроле биосинтеза стрептомицина S. griseus принимает участие плазмидная ДНК, в процессе биосинтеза - 20-30 генов. [9]
При промышленном производстве стрептомицина используются штаммы, хорошо развивающиеся на соевых средах, их основными компонентами является соевая мука, гидрол, аммонийные соли. Существенную роль в биосинтезе стрептомицина играют жиры соевой муки и её минеральный состав. Белок сои и его кислотный гидролизат малопригодны для биосинтеза антибиотика.
Аэрация среды имеет существенное значение, так как S. griseus - высокоаэробный организм и поглощает значительное количество кислорода, которое зависит от состава среды и стадии развития продуцента.
В ранний период развития актиномицета потребление кислорода воздуха более интенсивное, а затем оно падает до нуля. Увеличение степени аэрации повышает выход стрептомицина.
В анаэробных условиях продуцент стрептомицина развивается слабо. Мицелий, выращенный в аэробных условиях и перенесённый затем в анаэробные, стрептомицина не образует. Для максимального накопления антибиотика культура должна находиться в условиях непрерывной аэрации.
Оптимальная температура для развития антибиотика 27-29 °С. Повышение её до 30 ºС и выше резко снижает и даже прекращает его образование. Оптимальную температуру меняют в зависимости от штамма продуцента и состава среды.
Лучшим начальным рН для развития актиномицета является 7,0. Стрептомицин образуется при значении рН от 7,5 до 8,5.
В кислых средах активность стрептомицина снижается, в щелочных - максимальная. Так, активность стрептомицина при рН 5,8 в 20-80 раз меньше, чем при рН 8,0. Для проявления максимальной антимикробной активности стрептомицина оптимальное значение рН 7,5-8,0.
Наличие некоторых веществ в среде влияет на антибиотическую активность стрептомицина. Если к этой среде прибавить 0,5-3% натрия хлорида, калия хлорида или натрия сульфата, Е. coli развивается в присутствии 10 мкг/мл стрептомицина.
Имеется два объяснения этому факту: в присутствии натрия хлорида уменьшается скорость и степень диффузии стрептомицина, или натрия хлорид снижает адсорбцию антибиотика бактериальной клеткой.
При концентрации пировиноградной, фумаровой кислот до 1% продуцент развивается в присутствии 10 мкг/мл стрептомицина, если концентрацию солей повысить до 3%, рост бактерий наблюдается при концентрации антибиотика 150 мкг/мл.
Защитные свойства этих кислот по-разному проявляются по отношению к различным микроорганизмам. В отношении Е. coli защитные свойства проявляются в большей степени, в отношении Staph. aureus защитных свойств не наблюдается.
Сильно снижается активность стрептомицина в присутствии цистеина и гидроксиламина (цистеин полностью инактивирует антибиотик в течение нескольких часов).
При развитии продуцента различают две основные стадии. На первой стадии идёт быстрый рост и развитие микроорганизма с энергичным использованием основных компонентов субстрата, максимальное потребление кислорода.
В цитоплазме высокое содержание РНК, ДНК вначале отсутствует и обнаруживается только через 12 ч развития. В среде происходит некоторое увеличение аммонийного азота, связанное с разложением белков соевой муки. рН вначале несколько снижается, затем повышается с 6,8 до 7,9. Образование стрептомицина незначительное.
Через 28 ч масса мицелия прекращает увеличиваться, начинается вторая стадия - процесс образования стрептомицина. На третьи сутки рН с 7,9 падает до 6,7, а на четвёртые и пятые - вновь возрастает до 7,7.
Вторая стадия характеризуется медленным потреблением оставшихся в среде питательных веществ, замедлением роста актиномицета, снижением потребления кислорода, автолизом мицелия, максимальным образованием стрептомицина.
Максимальное накопление стрептомицина наблюдается, когда автолитические процессы начинают преобладать над процессами роста. Количество аммонийного азота продолжает возрастать, что, по всей вероятности, связано с разложением белков соевой муки и автолизом мицелия. В культуральной жидкости находятся минеральные вещества, белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, полисахариды, жиры, стрептомицин и другие вещества.
S. griseus при определённых условиях развития культуры образует ещё один антибиотик - маннозидострептомицин (стрептомицин В), в чистом виде вьщеленный в 1947г. из культуры актиномицета методом противоточной хроматографии.
Маннозидострептомицин отличается от стрептомицина наличием в молекуле маннозы. Он менее активен, чем стрептомицин. Культуры S. griseus содержат фермент, превращающий маннозидострептомицин в стрептомицин. При соответствующем контроле развития культуры актиномицета можно добиться минимального образования маннозидострептомицина.
Основная часть стрептомицина выделяется в культуральную среду, но часть его остаётся в мицелии и на его поверхности. С целью извлечения стрептомицина из микроорганизма культуральную жидкость вместе с биомассой обрабатывают минеральной кислотой. При этом весь антибиотик переходит в раствор.
Мицелий отделяют прессованием или центрифугированием. Свободную от мицелия культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. Этим достигается удаление белков и органических оснований, ионов металлов (кальция, магния, железа), далее ведётся выделение стрелтомицина в чистом виде.
Стрептомицин - сильно полярное соединение и его основание и соли неоргавических кислот хорошо растворимы в воде. Соли же органических кислот стрептомицина нерастворимы почти во всех органических растворителях.
Для выделения стрептомицина из культуральной жидкости в чистом виде используются методы адсорбции на активированном угле и метод ионообменной хроматографии.
В основу первого метода положена адсорбция стрептомицина на активированном угле при нейтральном или слабощелочном рН среды.
При рН 2-4 стрептомицин остаётся в растворе, в то время как примеси адсорбируются на сорбент. После удаления примесей на активированный уголь адсорбируют из подщелоченной среды антибиотик, его десорбцию осуществляют этанолом, подкисленным кислотой хлороводородной. Далее в раствор добавляется диэтиловый эфир - стрептомицин выпадает в осадок.
Стабильность стрептомицина имеет значение для производства и хранения антибиотика. Она зависит от чистоты препарата, влажности, температуры, рН растворителя.
Химически чистый стрептомицин устойчив в сухом состоянии и в виде растворов. Соли стрептомицина при хранении при комнатной температуре инактивируются лишь в незначительной степени на протяжении нескольких лет. Максимальная стабильность растворов стрептомицина сульфата и гидрохлорида находится при рН от 3,0 до 7,0 при температуре от 7 до 25 °С.
Грамицидин С. Продуцент Bacillus brevis способен синтезировать полипептидные актибиотики, к числу которых относят грамицидины А, В, СD, D, C. Последний иногда обозначают как грамицидин S (советский грамицидин). Все они отличаются как по аминокислотному составу, так и по пространственной структуре молекулы.
Для производства грамицидина. С (S) предложены среды на основе мясного и дрожжевого гидролизатов, содержащие сбалансированный набор минеральных и органических солей.
В процессе культивирования необходимо подобрать сбалансированное сочетание интенсивности аэрации среды (от 0,38 до 4,38 г О2(л/ч)) и концентрации входящих в неё веществ. Температура культивирования - 40°С. Развитие продуцента и синтез антибиотика может идти и при температуре 28 °С, но в этом случае максимальный биосинтез антибиотика наблюдается в первые 24 ч, в то время, как при температуре 40 С - между 24 и 48 ч.
При выделение грамицидина С культуральную жидкость подкисляют кислотой хлороводородной до рН 4,5-5,0. В осадок выпадает дихлоргидрат грамицидина С вместе с бактериальными клетками продуцента. Из осадка антибиотик экстрагируют этанолом. Концентрат, содержащий 4 % грамицидина, используется в медицинской практике.
Неомицины. В 1949г. З. Ваксмак и Х. Лешевалье из культуры Streptomyces fradiae выделили неомицин. В дальнейшем было установлено, что это комплекс, состоящий из семи антибиотиков аминогликозидного строения.
На синтетической среде актиномицет развивается лучше, чем на среде с соевой мукой, но биосинтез неомицина на синтетической среде почти в 8 раз ниже, чем на натуральной среде неопределённого состава. Некоторые вещества способствуют повышению выхода неомицина на 50%. К ним относятся ауксин, α-нафтилуксусная кислота.
Наиболее эффективная доза ауксинов - семь частей на миллион, внесённая в среду перед стерилизацией. Стимулирующий эффект ауксинов проявляется при продолжительности процесса 138-162 ч, в ранние сроки развития культуры эффект отсутствует.
В процессе образования антибиотика существенную роль играет цинк. Степень аэрации культуры должна быть несколько ниже, чем при выработке стрептомицина.
Неомицины - основания, хорошо растворимые в воде и нерастворимые в органических растворителях, наибольшая их антибиотическая активность проявляется в щелочной среде.
Неомициновый комплекс не теряет антимикробных свойств при длительном хранении (до 2-х лет) как в виде растворов, так и в твёрдом состоянии. [8]
|
|
|
