 |
С помощью какой серологической реакции можно определить наличие вируса иммунодефицита в организме человека и в чем сущность этой реакции?
|
|
|
|
Основным способом диагностики ВИЧ-инфекции и особенно выявления вирусоносительства является использование метода иммуноферментного анализа. Недостатком этого метода является то, что нередко он дает ложнопозитивные результаты. Поэтому в случае сомнения такая сыворотка подвергается контрольному испытанию более чувствительными специфическими методами, например с помощью метода иммуноблотинга или иммунопреципитации.
Обнаружение АТ с помощью ИФМ:
· Первый этап – адсорбция специфических АГ на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенстабилизированные луночки, т.е. на их стенках АГ уже адсорбированы.
· Второй этап – добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в них специфических АТ к данному АГ. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с АГ и образуют комплекс АГ – АТ.
· Третий этап – после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые АТ (антивидовые, т.е. АТ против человеческих иммуноглобулинов), но меченные ферментом. Таким образом образуется комплекс АГ + АТ + меченое АТ. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. В качестве контроля используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.
Предложены различные варианты иммуноферментного метода. Большое значение имеет вариант ИМФ, позволяющий осуществлять «захват» АТ, относящихся к IgM. Этот метод позволяет более точно производить серологическую диагностику, так как основан на обнаружении специфических иммуноглобулинов IgM, которые появляются в первую очередь при встрече с возбудителем.
Каков механизм реакции торможения гемагглютинации?
|
|
|
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) может быть использована для определения типа вируса или типа и титра АТ. Для определения типа вируса на предметное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала (количество капель должно соответствовать количеству сывороток). В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5%-ной взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 минут. При соответствии вируса типу сыворотки АТ связывают гемагглютинин вируса и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная). Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или АТ (антигемагглютининов).
Какие существуют методы культивирования вирусов? Как типируют (идентифицируют) вирусы?
Методы культивирования вирусов в культуре тканей:
1. цитопатический эффект – дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса
2. гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток
3. цветная реакция
4. метод бляшек
5. метод флуоресцирующих АТ
Методы культивирования вирусов в курином эмбрионе:
1. вскрытие зараженных куриных эмбрионов и изучение изменений в них
2. постановка реакции гемагглютинации
3. определение типа вируса гриппа в аллантоисной жидкости с помощью реакции торможения гемагглютинации
Определение типа вирусов в вирусосодержащем материале основано на нейтрализации вируса типоспецифическими сыворотками. Конечный результат реакции может быть установлен на основании следующих признаков:
· нейтрализация ЦПД
· нейтрализация реакции гемадсорбции
· цветная проба
· задержка (торможение) гемагглютинации
· свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием типоспецифических флуоресцирующих сывороток
|
|
|
· нейтрализация в опыте на животных
Как устроен ВИЧ?
ВИЧ шаровидной формы, его диаметр 110 нм. Оболочка вируса имеет форму многогранника, составленного из 12 пятиугольников и 20 шестиугольников. В центре и углах каждого шестиугольника расположена молекула гликозилированного протеина gp120 (число 120 означает молекулярную массу белка в килодальтонах). Всего на поверхности вириона располагаются в виде своеобразных шипов 72 молекулы gр120, каждая из которых связана с внутримембранным белком gр41. Эти белки вместе с двойным липидным слоем образуют суперкапсид (мембрану) вириона/
Белки gр120 и р41 образуются в результате нарезания клеточной протеазой белка-предшественника Env. Белок gр41 формирует «ножку» шипа, связываясь цитоплазматическим доменом с располагающимся непосредственно под оболочкой матриксным белком р17МА. Молекулы р17, взаимодействуя при созревании вириона, образуют икосаэдр, подстилающий оболочку.
В центральной части вириона белок р24 образует конусообразный капсид. Суженная часть капсида при участии белка р6 связана с оболочкой вириона. Внутри капсида заключены две идентичньте молекулы вирусной геномной РНК. Они связаны своими 5’-концами с нуклеокапсидным белком р7NС. Этот белок интересен тем, что имеет два аминокислотных остатка (мотива), богатых цистеином и гистидином и содержащих атом Zn, — их называют «цинковыми пальцами», так как они захватывают молекулы геномной РНК для включения в формирующиеся вирионы. В состав капсида входят также три фермента. Ревертаза (КТ), или роl-комплекс, включает в себя обратную транскриптазу, Р1IК-азу Н и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу. Ревертаза присутствует в виде гетеродимера р66/р51. Протеаза (РR) — р10, запускает и реализует процесс созревания вириона. Интеграза (IN) р31, или эндонуклеаза, обеспечивает включение провирусной ДНК в геном клетки-хозяина, В капсиде содержится также молекула затравочной РНК (тРНКЛИЗ).
РНК-геном в клетке с помощью обратной транскриптазы превращается в ДНК-геном (ДНК-провирус), состоящий из 9283 нуклеотодных пар. Он ограничен слева и справа так называемыми длинными концевыми повторами, или LTR (англ. Iоng terminal repeat): 5’-LTR —- слева и 3’-LTR — справа. LTR содержат по 638 нуклеотидных пар.
|
|
|
Геном ВИЧ состоит из 9 генов. часть из которых перекрывается концами (имеет
несколько рамок считывания) и имеет экзон-интронную структуру. Они контролируют синтез 9 структурных и 6 регуляторных белков.
Схематически структура генома ВИЧ выглядит так:
5'-LTR – gag pol vif vpr tat rev vpu env nef – 3’-LTR
Структурные гены и белки
Гены Белки
gag р17, р24, рТ, рб
pol р10 (протеаза), р66/51 — ревертаза
(обратная транскриптаза), РНК-аза Н,
ДНК-зависимая ДНК-полимераза),
р31(интеграза, или эндонуклеаза)
env gp140,gp41
Регуляторные гены и белки
tat — р14 (ТАТ) vif — р23 (VIF)
геv — р12 (REV) vpu— рIб (VPU)
nef --- р27 (NEF) vрг — -- (VPR)
Что такое иммуноблотинг и для какой цели он применяется?
Метод иммуноблотинга представляет собой тестирование твердофазным иммунологическим анализом электрофоретически разделенных белков.
Этот метод применяется для более точной диагностики ВИЧ-инфекции, так как основной метод диагностики нередко дает ложнопозитивные результаты.
|
|
|
