Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности

В основе мутаций на молекулярном уровне лежат две основные причины: ошибки репликации и мутагенные воздействия различной природы. Ошибки репликации возникают из-за того, что точность функционирования ДНК-полимераз не является абсолютной. Поскольку выбор очередного нуклеотида для включения в растущую цепь ДНК определяется в результате взаимодействия белков и ферментов системы репликации и матричной ДНК, изменение свойств этих белков или матрицы как спонтанно, так и под действием различных модифицирующих агентов может приводить к ошибкам в репликации ДНК и мутациям.

Ошибки репликации. Как уже обсуждалось в разделе 4.1, синтез ДНК происходит в результате последовательного ферментативного присоединения дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, комплементарных матричной ДНК, к 3’-концевому нуклеотиду растущей цепи ДНК. Точность этого процесса определяется различиями в свободной энергии у канонических или ошибочных пар азотистых оснований ДНК, образующихся по правилам Уотсона–Крика в водных растворах. Различия составляют ~1–3 ккал/моль и обеспечивают точность репликации в пределах не более одного ошибочно включенного нуклеотида на каждые 100 нуклеотидов.

Генетические методы определения частоты ошибок репликации, возникающих в процессе синтеза ДНК in vitro, бывают двух типов. При одном подходе измеряют частоту прямых мутаций, приводящих к инактивации какого-либо гена, изменение которого легко определить фенотипически. Удобной системой, основанной на таком принципе, является репликативная форма ДНК бактериофага M13mp2, содержащая часть гена b-галактозидазы в виде одноцепочечной бреши, застраивающейся испытуемой ДНК-полимеразой в бесклеточной системе. Ошибки синтеза ДНК в этом случае выявляют по потере или уменьшению активности b-галактозидазы, что не отражается на жизнеспособности бактериофага, который образуется после введения такой ДНК в бактериальные клетки с помощью трансфекции. С применением этого метода обнаруживают до 200 различных замен оснований, а также делеции, мутации со сдвигом рамок считывания и сложные генные перестройки.

При другом подходе к определению точности синтеза ДНК in vitro измеряют частоту обратных мутаций, восстанавливающих (под действием точковой мутации) последовательность нуклеотидов гена, активность белкового продукта которого была нарушена в результате, например амбер-мутации. Этот метод обладает большой чувствительностью, позволяя определять мутации, происходящие с частотами 10^-6–10^-8 на нуклеотид за одну генерацию. Однако он ограничен возможностью определения мутаций лишь одного конкретного типа.

Частота ошибок репликации увеличивается из-за спонтанных повреждений геномной ДНК, возникающих в результате ее депуринизации в физиологических условиях. Депуринизация является следствием разрыва N-гликозидной связи, соединяющей в молекуле ДНК пуриновые основания с остатками дезоксирибозы. По оценкам Линдаля и Ниберга депуринизация ДНК в организме происходит с частотой ~3 × 10^-11 на нуклеотид в секунду, что в ~100 раз выше частоты спонтанной потери пиримидиновых оснований ДНК в тех же условиях. Простой расчет показывает, что при такой частоте этих событий в соматической клетке человека должно происходить ~10⁵ депуринизаций/день. Репликативный комплекс на ДНК-матрице взаимодействует с апуринизированным сайтом и включает в синтезируемую цепь ДНК преимущественно остатки дезоксиаденозина.

Многие бактериальные и эукариотические ДНК-полимеразы, осуществляющие репликацию ДНК, обладают 3’®5’-экзонуклеазной корректирующей активностью, и поэтому ошибочно включенные нуклеотиды, некомплементарные матрице, удаляются с 3’-конца растущей цепи ДНК перед включением следующего нуклеотида в строящуюся цепь ДНК. Наличие у ДНК-полимеразных комплексов такой активности существенно повышает точность функционирования систем репликации.

Мутагенные воздействия. Усилий систем репликации становится недостаточно в стрессовых ситуациях, когда организм подвергается массированному мутагенному воздействию. Однако даже присутствие незначительного количества мутагенов в окружающей среде вызывает непрерывное накопление мутаций в геноме соматических клеток, хотя и с небольшой скоростью. Процесс накопления мутаций, избежавших коррекции системами репарации, является кумулятивным – к ранее существовавшим мутациям неуклонно добавляются новые, и суммарное количество мутаций в геноме (генетический груз) возрастает. Процесс накопления мутаций – статистический, поэтому в настоящее время можно предсказывать лишь вероятность возникновения конкретной мутации в генетическом локусе или геноме организма. Поскольку мутации часто являются причиной наследственных и приобретенных заболеваний, важно делать статистический прогноз частоты возникновения определенных заболеваний в популяциях, для которых известна мутагенная экологическая обстановка.

Ионизирующее излучение. Ярко выраженным мутагенным действием обладают коротковолновое электромагнитное излучение (УФ-свет, рентгеновские лучи), а также элементарные частицы, образующиеся в процессе радиоактивного распада вещества. С помощью рентгеновского излучения Г. Меллером в 1927 г. впервые были получены мутации у дрозофилы. С тех пор исследования механизмов мутагенеза проводятся все интенсивнее и в широких масштабах.

Электромагнитное излучение, проходящее через вещество, или элементарные частицы передают свою энергию атомам. В результате первичного столкновения с квантами излучения или частицами из атома, который превращается в положительно заряженный ион, выбиваются электроны. Освобожденные электроны вторично вызывают образование пар ионов при перемещении до тех пор, пока их энергия не иссякнет и они не утратят свою ионизирующую способность. Единицей дозы излучения служит рентген (Р) – количество излучения, которое вызывает образование 2·10⁹ пар ионов/см³ воздуха. На практике часто пользуются единицей рад, служащей мерой поглощения энергии; в воздухе 1 Р эквивалентен 0,876 рад. Для объяснения механизмов возникновения мутаций под действием ионизирующего излучения была применена ранее разработанная теория мишени, в соответствии с которой повреждение ДНК наблюдается в том месте, где имеет место первичная ионизация. Реакция происходит внутри дискретного объема, являющегося мишенью. Повреждения ДНК возникают как вследствие прямого попадания кванта излучения или элементарной частицы в молекулу, так и в результате вторичного действия иона, образовавшегося за пределами ДНК в некоем "чувствительном объеме". Установлено, что частота мутаций, возникающих у дрозофилы и других объектов, прямо пропорциональна дозе облучения. Определенная доза облучения вызывает одинаковое число мутаций как при однократном, так и при дробном облучении небольшими порциями.

Химические мутагены экзогенного происхождения. Многие химические соединения, встречающиеся в окружающей среде, обладают способностью взаимодействовать с ДНК или с ее низкомолекулярными предшественниками и вызывать мутации. При этом одни химические соединения изначально являются реакционноспособными мутагенами, непосредственно соединяющимися с ДНК и изменяющими ее химическую структуру, а другие, так называемые промутагены, для превращения в мутагены сначала претерпевают метаболическую активацию под действием ферментативных систем организма.

Одним из наиболее обширных классов химических мутагенов экзогенного происхождения являются алкилирующие агенты, под действием которых происходит спонтанный (без участия ферментативных систем организма) перенос алкильных групп этих химических соединений на биологические макромолекулы, в том числе и ДНК. В табл. I.18 представлены основные классы алкилирующих агентов. В структурах химических соединений, приведенных в таблице, можно выявить различия по двум признакам, роль которых в мутагенной активности алкилирующих агентов была неоднократно подтверждена экспериментально. Один из признаков относится к типу переносимых алкильных групп: метильной, этильной или более сложной. Другой отличительный признак – число алкильных групп, которые отдает одна молекула алкилирующего агента. Это свойство называется функциональностью соединения. Так, среди азотистых ипритов H₂NCH₂CH₂Cl – монофункционален, HN(CH₂CH₂Cl)₂ – бифункционален, а N(CH₂CH₂Cl)₃ – трифункционален.

Главным источником мутаций, возникающих под действием алкилирующих агентов, является алкилирование O-6 в гуанине и O-4 в тимине ДНК. Другими сайтами, алкилирование которых реже приводит к мутациям, могут быть N-3 гуанина, N-1, N-3 и N-7 аденина, N-3 цитозина, а также N-3 и N-4 тимина. При этом спектр мутаций, возникающих под действием любого алкилирующего агента, как правило, специфичен. Следует отметить, что благодаря функционированию репаративных систем клетки к возникновению мутаций приводит лишь небольшая часть алкилирований ДНК. Поэтому частота реакций между алкилирующим агентом и ДНК не связана простой зависимостью с их мутагенной активностью. То же самое относится не только к алкилирующим агентам, но и к другим мутагенам.

Таблица I.18