Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений

Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечивающих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках животных и растений, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы, помимо всего прочего, должны быть челночными векторами. Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток.

В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или, в зависимости от задач, эукариотических генов домашнего хозяйства, а также генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия.

Экспрессирующий вектор pKSV-10. Структура теоретически возможного эукариотического вектора для экспрессии клонированных генов в клетках животных представлена на рис. II.12, из которого видно, что эукариотический вектор сохраняет все основные генетические элементы бактериальных векторов. Это, прежде всего, репликатор (область начала репликации ori), распознаваемый репликативными системами эукариотической клетки. В роли репликатора чаще всего используют соответствующие последовательности нуклеотидов вирусов животных (например вируса SV40 или вируса Эпштейна–Барр). Особенностью функционирования такого репликатора является потребность в вирусных белках для инициации репликации. Так, в случае SV40 – это T-антиген, тогда как у вируса Эпштейна-Барр – белок EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen). Для того чтобы репликация векторов, в которых использованы вирусные репликаторы, осуществлялась без вируса-помощника, получили специальные линии клеток, которые стабильно продуцируют соответствующие вирусные белки. Например, в клетках линии COS синтезируется T-антиген вируса SV40, а клетки линии Hep-EBNA-2 экспрессируют ген EBNA.

Рис. II.12. Эукариотический вектор pKSV-10

Часть бактериальной плазмиды, содержащей область начала репликации ori, соединена с транскрипционной единицей вируса SV40, 5’-концевая часть которой включает ранние промотор и репликатор вируса SV40, а 3’-конец содержит сайт полиаденилирования и интрон большого T-антигена. Последовательности чужеродной ДНК, которые необходимо экспрессировать в клетках животных, клонируют по Bgl II-сайту рестрикции. Кроме того, в векторе имеются уникальные сайты для рестриктаз Kpn I, BamH I, Sal I и EcoR I. Вектор может реплицироваться в клетках E. coli и в клетках обезьян линии COS

В ряде случаев гены, необходимые для репликации эукариотического вектора, вводят непосредственно в вектор. Так же как и бактериальный, эукариотический вектор должен содержать один или несколько уникальных сайтов рестрикции для клонирования требуемой последовательности нуклеотидов. В экспрессирующем векторе полилинкер располагают непосредственно за генетическими элементами, регулирующими транскрипцию (наибольшее значение из них имеют промотор и энхансер), перед сайтом полиаденилирования и терминатором транскрипции. Структура других кассет генов, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных генов в клетках животных, будет рассмотрена в разделе 7.4.6.

Векторы растений. Специфика векторов для экспрессии рекомбинантных генов в клетках растений обусловлена главным образом регуляторными последовательностями нуклеотидов, которые обеспечивают эффективную транскрипцию генов в растительных тканях. Например, в известном векторе pCaMVCAT используются промотор и сайт полиаденилирования генов вируса мозаики цветной капусты, под контролем которых находится ген бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (cat). Этот ген-репортер применяется для оптимизации условий введения векторной ДНК в клетки растений и может быть заменен на любой другой ген. Вектор pCaMVCAT является челночным, т.е. может реплицироваться как в клетках E. coli, так и растений. В первом случае селектируемым маркером служит, как обычно, ген устойчивости к ампициллину.

Вектор pCaMVCAT принадлежит к большой группе так называемых DMGT-векторов (DNA-mediated gene transfer), осуществляющих опосредованный ДНК перенос генов в клетки растений. Это означает, что в данном случае перенос генов в клетки растений опосредован ДНК вектора, так как они находятся в составе векторной молекулы. Для получения стабильных линий растительных клеток, которые бы содержали рекомбинантные ДНК в интегрированном в хромосомы состоянии и активно экспрессировали его, часто в состав DMGT-векторов вводят дополнительные селектируемые маркеры, которые придают клеткам, включившим экзогенную ДНК, определенный, легко обнаруживаемый фенотип. Такими маркерами могут быть, например гены неомицинфосфотрансферазы II (NPT II), гигромицинфосфотрансферазы (HPT), дигидрофолатредуктазы, в результате экспрессии которых клетки приобретают устойчивость к канамицину, гигромицину B или метотрексату соответственно.

Клонотеки генов

Любой индивидуальный ген занимает лишь небольшую часть генома живого организма. В то же время размер генома даже наиболее просто организованных бактерий в среднем составляет 2•10⁶ п.о., а суммарный размер молекул ДНК, составляющих гаплоидный геном человека, по крайней мере, на три порядка больше. Из этого следует, что уникальные гены, представленные в гаплоидном геноме только одной копией, затеряны среди других последовательностей генома, и для работы с индивидуальными рекомбинантными ДНК требуется очистка от ненужного генетического материала. Такая задача в генной инженерии решается через создание репрезентативных (представительных) клонотек последовательностей нуклеотидов ДНК или, иначе говоря, клонотек генов.

Получение клонотек генов

Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или какую-либо известную его часть. При этом репрезентативная клонотека должна заключать в себе с высокой долей вероятности любую последовательность нуклеотидов изучаемого генома. Как уже подробно обсуждалось выше, для большинства генов эукариот характерна интрон-экзонная структура, а интроны, присутствующие в первичных транскриптах таких генов, вырезаются в процессе сплайсинга с образованием зрелых молекул мРНК. Для получения экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот, а также изучения тканеспецифической экспрессии генов возникает необходимость в получении кодирующих последовательностей эукариотических генов без интронов. В этом случае задача решается через создание репрезентативных клонотек кДНК, в которых с высокой вероятностью представлены последовательности нуклеотидов мРНК, синтезирующихся в тканях, культурах тканей или отдельных соматических клетках.

На рис. II.8 представлена схема конструирования клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора. Следует иметь в виду, что общие принципы получения клонотек генов приложимы и к любым другим векторам. На первом этапе конструирования осуществляют подготовку вектора и клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами BamH I и Sma I, причем рестриктаза Sma I расщепляет ДНК с образованием "тупых" концов. В результате образуются два "плеча" космидного вектора, содержащих область начала репликации ori, используемую системой репликации бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют собой гены устойчивости к антибиотикам – ампициллину (Amp^r) и канамицину (Kan^r), а также два cos -сайта хромосомы бактериофага l. Параллельно со всеми необходимыми предосторожностями получают препараты высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать.

Геномную ДНК подвергают частичному гидролизу мелкощепящей рестриктазой Mbo I (узнает последовательность из четырех нуклеотидов GATC, которые комплементарны "липким" концам, образуемым рестриктазой BamH I). Время рестрикции и концентрацию фермента подбирают таким образом, чтобы средняя длина образующихся фрагментов ДНК составляла 35–45 т.п.о. Обогащенную фракцию фрагментов ДНК подобного размера далее получают центрифугированием смеси рестрикционных фрагментов в градиенте концентрации сахарозы и лигируют с приготовленными "плечами" вектора в условиях, при которых образование сшивок по "тупым" концам минимально. При этом, помимо требуемых молекул рекомбинантных ДНК, могут образовываться и артефактные молекулы, которые не будут упаковываться в фаговые частицы либо из-за их неоптимального размера, либо вследствие неправильной ориентации cos -сайтов.

Полученную после лигирования сложную смесь молекул рекомбинантных ДНК упаковывают в фаговые частицы стандартным способом, и образовавшимися фаговыми частицами заражают подходящие бактериальные клетки. В итоге колонии бактериальных клеток, которые выросли в присутствии антибиотиков, должны заключать в себе различные последовательности нуклеотидов клонируемой ДНК приблизительно одинаковой длины.

На этом частном примере был рассмотрен один из подходов к конструированию клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора, который иллюстрирует все основные этапы получения клонотек генов с применением и других векторов, плазмидных или фаговых. Во всех случаях для получения репрезентативных клонотек генов следует помнить о необходимости случайной фрагментации клонируемой высокомолекулярной ДНК, с тем чтобы все участки генома в образующейся смеси фрагментов были представлены равновероятно. Кроме того, размеры образуемых фрагментов ДНК должны соответствовать емкости вектора, используемого для их клонирования. Так, для клонирования в космидах необходимо получать фрагменты ДНК длиной 35–45 т.п.о., тогда как для клонирования в фаговых векторах типа Charon и плазмидах эти размеры должны составлять соответственно 20–24 и 1,5–3,0 т.п.о.

Чем короче фрагменты, используемые для получения библиотек генов, и чем сложнее исследуемый геном, тем большее число клонов необходимо получить, чтобы клонотека была полной. Например, для того чтобы создать геномную клонотеку бактерий из фрагментов ДНК длиной в 20 т.п.о., в которой любая последовательность была бы представлена с вероятностью 99%, в ней необходимо иметь 460 клонов, тогда как для млекопитающих это число возрастает до 600000, а для покрытосеменных растений оно еще в ~10 раз больше. Отсюда следует, что в случае получения репрезентативных клонотек генов бактерий для решения такой задачи вполне достаточно плазмидных векторов, несмотря на их небольшую емкость. В то же время использование плазмид для создания полных клонотек генов млекопитающих или растений совершенно бесперспективно, так как потребовало бы поддержания в клонотеке огромного количества клонов, многие из которых с большой вероятностью могут быть утрачены.

Выше были обсуждены условия, которые необходимо соблюдать для получения репрезентативных клонотек геномной ДНК. Однако во многих случаях не возникает необходимости работать с полными клонотеками генов, и исследователи ограничиваются неполными клонотеками, обогащенными отдельными участками генома. Так, клонотеки кДНК заключают в себе последовательности нуклеотидов, которые в виде зрелых мРНК специфически экспрессируются в различных клетках или тканях. То же можно сказать и о клонотеках повторяющихся последовательностей нуклеотидов, отобранных из препарата суммарной ДНК на основании кинетики их реассоциации.