 |
Рис. 33. Схематическое изображение синтеза ДНК в репликативной вилке
|
|
|
|
А
Б
Рис. 33. Схематическое изображение синтеза ДНК в репликативной вилке
(А - цит. по Lodish, 2003; Б - цит. по Северину, 2008)
Рис. 34. Схематическое изображение этапов синтеза ДНК (цит. по Nelson, Cox, 2004)
 |
Рис. 35. Удаление праймеров из отстающей цепи в синтезе ДНК (цит. по Северину, 2008)
Терминация репликации. У прокариот при достижении ДНК-полимеразой определенной терминаторной последовательности синтез дочерней цепи ДНК прекращается.
Этапы репликации у эукариот.
Клетка эукариот содержит несколько ДНК-полимераз.
1 - Обладающие только полимеразной активностью:
ДНК-полимераза α – находится в ядре, основной фермент репликации;
ДНК-полимераза b - локализована в ядре, является репарирующей ДНК-полимеразой; ДНК-полимераза g - осуществляет репликацию ДНК в митохондриях и хлоропластах; 2 - Обладающие полимеразной и 3’→ 5’-экзонуклеазной активностями:
ДНК-полимераза s - принимает участие в репликации отстающей цепи; ДНК-полимераза e - принимает участие в синтезе лидирующей цепи ДНК.
Так как ДНК в хромосоме эукариот линейна, то при репликации праймер у 3’-конца родительской цепи разрушается, но ДНК-полимераза не может достроить ДНК, т. к. нет 3’-ОН- конца, поэтому для предотвращения укорочения цепи на концах ДНК находятся участки нереплицируемой ДНК – теломеры (длина 10-15 тыс. пар оснований). На этом участке синтезируется праймер. Теломеры удлиняются с помощью фермента теломеразы. В норме теломераза присутствует только в половых и стволовых клетках.
Т. о. теломеры выполняют роль «буферной зоны», а также защищают концы ДНК от действия экзонуклеаз и позволяют концам хромосом прикрепляться к ядерной мембране.
|
|
|
Синтез ДНК начинается с образования праймера. Его образование катализирует праймаза – субъединица, входящая в состав ДНК-полимеразы α. Далее этот же фермент переключается на синтез ДНК и включает в синтезируемую цепь около 60 дезоксинуклеотидов, после чего заменяется другими ДНК-полимеразами. Продолжают синтез ДНК ДНК-полимеразы δ и ε, которые обладают экзонуклеазной активностью и в ходе синтеза могут отщеплять неправильно включенный нуклеотид. Это обеспечивает высокую точность синтеза ДНК.
В отстающей цепи ДНК каждый фрагмент Оказаки содержит около 200 нуклеотидов, включающих РНК-праймер и участок ДНК. Праймер удаляется эндонуклеазой и РНКазой, а ДНК-полимераза β заполняет образующуюся «брешь» по принципу комплементарности, используя дНТФ в качестве субстратов (рис. 35).
ДНК-лигаза объединяет фрагменты в полинуклеотидную цепь. Кофактором всех стадий репликации является ион Mg2+.
По хромосоме эукариот в каждый момент времени независимо могут двигаться множество репликативных вилок. Остановка вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, движущейся в противоположном направлении, или по достижении конца хромосомы. Процесс завершения слияния репликативных вилок можно считать терминацией репликации у эукариот. В результате вся ДНК хромосомы оказывается реплицированной.
После деления каждая дочерняя клетка получает диплоидный набор хромосом, идентичный материнской клетке.
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) была осуществлена в 1985 г на фирме Cetus. ПЦР – осуществляемая in vitro – специфическая амплификация нуклеиновой кислоты, инициируемая синтетическими праймерами. Цикл состоит из температурной денатурации ДНК, её отжига с праймером и элонгации. Смена этих этапов происходит в результате изменения температуры. В ПЦР используют термостабильную ДНК-полимеразу Taq (Thermus aquaticus).
|
|
|
