Методы цитологических исследований

1. Методы приготовления цитологических срезов.

2. Методы окрашивания.

3. Методы микроскопирования цитологических препаратов.

Подготовка материала к гистологическому исследованию. Основным методом в гистологических исследованиях является изучение окрашенных срезов различных тканей и органов. Традиционный способ подготовки материала для получения постоянного гистологического препарата включает: (1) фиксацию материала, (2) проводку (обезвоживание), (3) заливку (уплотнение), (4) приготовление гистологических срезов (резку), (5) окрашивание срезов, (6) заключение срезов.

1. Фиксация гистологического материала (от лат. fixatio - закрепление) осуществляется для " закрепления" его прижизненного строения. Она предотвращает разложение извлеченных из организма тканей под действием собственных ферментов (процесс аутолиза - от греч. аutos - сам и lysis - распад), а также ферментов микроорганизмов и способствует сохранению целостности клеточных и тканевых структур. Воздействуя на ткани, фиксатор (например, формалин, спирт, пикриновая кислота или различные сложные смеси веществ), вызывает необратимую коагуляцию белков и быструю гибель клеток. Наиболее часто используют иммерсионную фиксацию - погружение (иммерсию - от лат. immersio - погружение) кусочка органа в раствор фиксатора; в экспериментальных условиях фиксатор нередко вводят через сосудистую систему (перфузионная фиксация - от лат. perfusio - вливание).

2. Проводка (обезвоживание) материала осуществляется путем последовательного помещения кусочка в спирты возрастающих концентраций для удаления из него воды. Она необходима для выполнения следующего этапа обработки материала - его заливки.

3. Заливка (уплотнение) материала достигается путем пропитывания обезвоженного кусочка затвердевающими средами: расплавленным парафином, целлоидином или специальной пластической массой. В результате заливки после охлаждения парафина или полимеризации пластмассы кусочек ткани (блок) становится достаточно плотным для получения тонких срезов при резке.

4. Приготовление гистологических срезов (резка) осуществляется на специальном приборе (микротоме) с помощью особых стальных ножей - бритв. При этом обычно получают срезы залитого в парафин или другую среду материала толщиной 5-7 мкм (в оптимальном варианте - серийные, т. е. следующие один за другим в виде непрерывной ленты).

5. Окрашиваниесрезов обычно производится после их монтирования (приклеивания) на предметное стекло и удаления из них парафина (депарафинирования). Окрашивание позволяет выявить различные структурные компоненты тканей и клеток благодаря их неодинаковому сродству к гистологическим красителям.

Гистологические красители разделяются на две главные группы - основные и кислые.

Основные красители (например, гематоксилин, толуидиновый и метиленовый синий, азур II) активно связываются со структурами, содержащими кислоты (например, ДНК и РНК) и несущими отрицательный заряд. Способность окрашиваться основными красителями называется базофилией (от греч. basis - основание и philia любовь), структуры, связывающие эти красители - базофильными.

Метахромазия (от греч. meta - изменение и chroma - краска) - изменение цвета отдельных основных красителей, (например, толуидинового синего, азура II или тионина) при их связывании с некоторыми структурами, обладающими специфическими химическими свойствами (обычно высокой концентрацией сульфатированных гликозаминогликанов).

Кислые красители (например, эозин, эритрозин, оранж G, лихтгрюн) связываются с различными структурами, несущими положительный заряд. Способность окрашиваться кислыми красителями называется оксифилией, или ацидофилией (от греч. oxys или лат. acidus - кислый и греч. philia - любовь), а структуры, связывающие

эти красители - оксифильными, или ацидофильными. Оксифилия свойственна цитоплазме клеток (в особенности, при высоком содержании в ней митохондрий и некоторых белковых секреторных гранул), эритроцитам (благодаря высокой концентрации в них гемоглобина).  

Комбинированное окрашивание препаратов основано на использовании как основных, так и кислых красителей, обладающих контрастирующими цветами. Наиболее распространенная общеобзорная окраска гистологических препаратов сочетает гематоксилин (основной краситель) с эозином (кислым красителем).

Избирательное (элективное, специальное) окрашивание препаратов, в отличие от общеобзорных методов, выявляет не общую морфологическую картину, а какие-то конкретные структуры, обладающие высоким сродством к определенным красителям. Так, для избирательного выявления в тканях эластических элементов (волокон, мембран) применяют окраску орсеином; жировые клетки и липидные включения в различных клетках окрашивают суданом III или четырехокисью осмия; ретикулярные волокна, нервные и некоторые эндокринные клетки - импрегнацией (от лат. impregnatio - пропитывание) солями серебра.

Цито- и гистохимические методы исследования направлены на выявление в клетках и тканях конкретных химических веществ (например, железа, кальция, белков, липидов, нуклеиновых кислот, гликогена, ферментов) или химических групп (например, альдегидных, сульфгидрильных, аминогрупп). Они основаны на специфическом связывании красителей с определенными химическими соединениями

(например, РНК и ДНК) или образовании окрашенных продуктов из неокрашенных в участке расположения искомого вещества (например, фермента) в результате гистохимической реакции его выявления.  

ШИК- или (РАS)-реакция - пример одного из наиболее широко используемых гистохимических методов. Название метода происходит от сокращения терминов Ш иффа (реактив) - И одная К ислота (по англ. P eriodic A cid S chiff). Метод используется для выявления соединений, богатых углеводными группами - гликогена, гликопротеинов, мукопротеинов, протеогликанов и др. Он основан на окислении йодной кислотой гидроксильных групп сахаров до альдегидных, с которыми связывается бесцветный реактив Шиффа (содержащий фуксин), превращаясь в стабильное соединение красного цвета.

Иммуноцитохимические и иммуногистохимические методы обеспечивают наиболее специфическое выявление веществ в клетках итканях. Они основаны на обработке мазков или срезов маркированными специфическими антителами к выявляемому веществу, которое служит антигеном.

Витальная окраска . Некоторые красители (например, трипановый синий, литиевый кармин, тушь) не являются токсическими по отношению к живым клеткам и не разрушаются ими. Они представляют собой не истинные растворы, а взвесь частиц. При их введении в организм (чаще всего в кровь) эти красители активно захватываются фагоцитирующими клетками и накапливаются в них, тем самым маркируя эти клетки.

Суправитальная окраска основана на связывании некоторых красителей с компонентами живых клеток, извлеченных, из организма. Так, митохондрии окрашиваются янусом зеленым.

Стандартная световая микроскопия осуществляется путем изучения препарата в проходящем свете.

Разрешающая способность (разрешение) микроскопа - минимальное расстояние между двумя точками объекта, которые видны в нем раздельно.

Темнопольноя микроскопия (микроскопия в темном поле) основана на использовании специального конденсора, обеспечивающего освещение препарата косыми лучами, не попадающими в объектив. В отсутствие объектов поле зрения представляется темным.

Фазово-контрастная микроскопия основана на неодинаковом изменении фазы световых лучей при их прохождении через различные структуры изучаемого объекта. Фазово-контрастный микроскоп преобразует незаметные для человеческого глаза фазовые различия в амплитудные.

Поляризационная микроскопия используется для изучения структур, обладающих свойствами анизотропии или двойного лучепреломления. В поляризационном микроскопе на объект направляется поляризованный пучок света, который в дальнейшем пропускается через анализатор (расположенный между объективом и окуляром) - устройство, определяющее отклонения плоскости поляризации света вследствие его прохождения через объект. Тем самым выявляется закономерное пространственное расположение молекул в объекте.

Ультрафиолетовая микроскопия связана с освещением изучаемого объекта ультрафиолетовыми лучами, которые избирательно поглощаются его структурными компонентами. Благодаря тому, что ультрафиолетовые лучи имеют более короткую длину волны по сравнению с лучами видимой части спектра, разрешающая способность микроскопа повышается примерно вдвое.