 |
Выделение сапонинов. Качественное обнаружение. Количественное определение
|
|
|
|
Выделение сапонинов
Выделение сапонинов из растительного сырья идет по общей схеме выделения природных соединений и состоит из следующих этапов:
1. Получение экстракта с использованием в качестве растворителей метилового, этилового спиртов и воды. Сырье предварительно обрабатывают петролейным эфиром или четыреххлористым углеродом для разрушения комплексов сапонинов со стеринами, которые нерастворимы в спиртах.
2. Упаривание, очистка и выделение из полученного экстракта сапонинов с использованием колоночной хроматографии на оксиде алюминия, силикагеле и др. сорбентах.
Ряд методов основан на способности сапонинов образовывать нерастворимые в воде или водном растворе спиртов соли с гидроксидом бария, ацетатом свинца или комплексы с холестерином, белками. Полученные соли или комплексы отделяют и разрушают с помощью специальных реактивов и получают более чистые суммы сапонинов, которые подвергают дальнейшему разделению на индивидуальные компоненты.
Качественное обнаружение
Для качественных реакций на сапонины готовят водное извлечение из РС 1: 10, нагревая его на водяной бане в течение 10 мин. Охлаждают, фильтруют и с фильтратом проводят качественные реакции.
При обнаружении сапонинов в РС используют реакции трех типов:
1. Реакции, основанные на физических свойствах сапонинов.
2. Реакции, основанные на химических свойствах сапонинов.
3. Реакции, основанные на биологических свойствах сапонинов.
К первой группе относится реакция пенообразования. Это не только чувствительная, но и довольно характерная проба, т. к. других веществ, обладающих такой способностью к пенообразованию, в растениях не встречается. Для ее выполнения берут две пробирки, в одну приливают определенный объем 0, 1 н. NаОН (рН=13), в другую 0, 1 н. раствор НСl (рН=1). В обе пробирки добавляют по 3-4 капли извлечения или раствора сапонина и сильно встряхивают. Если в сырье содержатся тритерпеновые сапонины, то в обеих пробирках образуется пена, равная по объему и стойкости. При наличии сапонинов стероидной группы в щелочной среде образуется пена, в несколько раз больше по объему и стойкости.
|
|
|
Ко второй группе обнаружения сапонинов в РС относятся реакции осаждения сапонинов и цветные реакции. Из водных растворов сапонины осаждаются гидроксидом бария и магния, солями меди, ацетатом свинца (тритерпеновые сапонины осаждаются средним ацетатом свинца, стероидные – основным). Из спиртовых извлечений (или растворов) стероидные и тритерпеновые сапонины выпадают в осадок при добавлении спиртового раствора холестерина в виде холестеридов.
К 2 мл водного извлечения прибавляют 1 мл 10% раствора нитрата натрия и 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется кроваво-красное окрашивание.
К 2 мл водного извлечения прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл этилового спирта и 1 каплю 10% раствора сернокислого железа. При нагревании появляется сине-зеленое окрашивание (реакция Лафона).
Стероидные сапонины, как и сердечные гликозиды, дают реакцию Либермана-Бурхардта с образованием розового окрашивания, переходящего в зелено-синее.
К третьей группе реакций на сапонины относится реакция гемолиза эритроцитов крови за счет образования комплексов с холестерином мембран эритроцитов, вследствие чего оболочка эритроцита из полупроницаемой становится проницаемой, и гемоглобин выходит в плазму крови, окрашивая ее в красный цвет.
К 1 мл извлечения на изотоническом растворе добавляют 1 мл 2% взвеси эритроцитов в изотоническом растворе. Кровь становится прозрачной, ярко-красной (гемолиз). Ввиду того, что различные сапонины при одинаковой концентрации имеют разный гемолитический индекс (механизм гемолиза также различен), каждое сырье должно иметь свой стандарт – раствор чистого сапонина.
|
|
|
Для обнаружения сапонинов в растениях методом хроматографии используют спиртовые извлечения из сырья, которые хроматографируют в условиях, указанных в нормативной документации и после высушивания обрабатывают соответствующими реактивами. При определении стероидных сапонинов хроматограмму опрыскивают реактивом Санье (5% спиртовым раствором ванилина) и 10 мин нагревают в сушильном шкафу при температуре 110°С, затем опрыскивают 50% раствором серной кислоты и снова высушивают. При наличии стероидных гликозидов появляются пятна желтого цвета.
При определении тритерпеновых сапонинов (в случае аралозидов) хроматограмму опрыскивают 20% раствором серной кислоты, затем нагревают в сушильном шкафу при температуре 110°С в течение 10 мин. Аралозиды проявляются в виде пятен вишневого цвета.
Количественное определение
Единого метода количественного определения сапонинов в сырье нет. Использовавшиеся гравиметрические методы и методы, основанные на физических и биологических свойствах сапонинов, малоспецифичны и не точны.
В настоящее время чаще используют физико-химические методы. Они основаны на сочетании хроматографического разделения сапонинов с последующим количественным определением их. Для этой цели используют чаще спектрофотометрические методы.
Суммарная фракция сапонинов, производных тритерпеновых кислот, может быть определена титриметрическими методами. Используются методы потенциометрического титрования (корни аралии манчжурской), титрования в неводных средах. Диосгенин в корневищах с корнями диоскореи дельтовидной определяют методом газовой хроматографии.
Стероидные сапонины на ТСХ дают розовые пятна при проявлении парами ортофосфорной кислоты и интенсивно флуоресцируют в УФ-свете. Количество вещества определяют по флуоресценции с помощью флуориметра.
|
|
|
