 |
От чего зависит заряд белка в водном растворе? Что такое
|
|
|
|
Изоэлектрическое осаждение? Как зависит растворимость белков от
Температуры и pH раствора?
Белки бывают растворимые и нерастворимые в воде. Растворимость белков зависит от их
структуры, величины рН, солевого состава раствора, температуры и других факторов и
определяется природой тех групп, которые находятся на поверхности белковой молекулы. К
нерастворимым белкам относятся кератин (волосы, ногти, перья), коллаген (сухожилия), фиброин
(щелк, паутина). Многие другие белки растворимы в воде. Растворимость определяется наличием
на их поверхности заряженных и полярных группировок (-СОО-
, -NH3
+
, -OH и др.). Заряженные и
полярные группировки белков притягивают к себе молекулы воды, и вокруг них формируется
гидратная оболочка (рис. 15), существование которой обусловливает их растворимость в воде.
Растворимость белков зависит и от рН растворов. Как мы уже отмечали, минимальной
растворимостью обладают белки в изоэлектрической точке, что объясняется отсутствием
электростатического отталкивания между молекулами белка. Изменяя pH среды, меняется
степень диссоциации функциональных групп аминокислот, а значит меняется величина заряда. В
изоэлектрическом состоянии белок минимально гидратирован и выпадает в осадок. Между
температурой и растворимостью белка строгой зависимости не имеется. Одни белки
(глобулины, пепсин, фосфорилаза мышц) в водных или солевых растворах с повышением
температуры растворяются лучше; другие (альдолаза мышц, гемоглобин и другие) - хуже.
Изоэлектрическое осаждение - при приближении рН раствора к изоэлектрической точке, белок
теряет заряд и осаждается из раствора (пример: осаждение казеина молока при его скисании). Этот
|
|
|
процесс осаждения в начальных стадиях носит обратимый характер и может быть использован для
разделения белков.
6. Как влияет на растворимость белка добавка солей,
Органических и минеральных кислот, растворителей,
Алкалоидов? Какие существуют методы преципитации
Белков?
При добавлении небольших концентраций в раствор белка, повышается
растворимость белков. Но при добавлении больших концентраций солей,
белки будут выпадать в осадок, структура их при этом не повредится.
При добавлении минеральных кислот
Концентрированные кислоты (HS,HCl,HNO3 и др.) вызовут денатурацию
белка, за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (напомню,
это заряд белка и его гидратная оболочка)
При добавлении органических кислот.
Трихлоруксусная кислота осаждает только белки! А вот,
сульфацилсалициловая способна и к осаждению высокомолекулярных
пептидов.
При добавлении алкалоидов.
-Танин
- Раствор йода в йодистом калии(Реактив Бушара)
- Раствор висмута в йодистом калии (Реактив Драгендорфа)
- Пикриновая к-та и др.
Все перечисленное выше относится к алкалоидам, при добавлении их в
раствор они образуют нерастворимые соединения с белками. Растворить
осадок можно при добавлении щелочей.
Какие существую методы преципитации белков?
Осаждение — это образование твердого осадка в растворе в ходе
химической реакции, например, добавлением соответствующих реагентов.
По окончании реакции, образовавшийся сухой остаток называют
преципитатом, а жидкость выше него — супернатантом
Сам метод заключается в выделении из раствора химических компонентов в
виде малорастворимого соединения.
Один из наиболее распространённых в химическом анализе метод
разделения элементов, на котором основаны методы качественного и
количественного анализа.
Вопрос 7
|
|
|
Фибриллярные – соотношение осей >10. Они состоят из пучков полипептидных цепей, спиралью навитых друг на друга и связанные между собой поперечными ковалентными и водородными связями. Выполняют защитную и структурную функции. Например: кератин, миозин, коллаген.
Коллаген существует в виде тройной спирали,механически стойкой и прочной.Его содержание особенно высоко в сухожилиях, связках соединительной ткани, мышцах, коже и других тканях, испытывающих на себе сильное механическое воздействие
Глобулярные – соотношение продольной и поперечной осей составляет <10 и в большинстве случаев не более 3-4. Они характеризуются компактной укладкой полипептидных цепей. Например: инсулин, альбумин, глобулины плазмы крови
Выполняют различные функции в клетках. Хорошо растворимы, поскольку на поверхности белковой молекулы расположены преимущественно полярные аминокислоты, а неполярные аминокислоты скрыты в ядре белка. Полярные аминокислоты участвуют в диполь-дипольных взаимодействиях
Вопрос 8
Нативной (природной, неизменной) конформацией называют характерную трехмерную структуру белка, в которой он стабилен и проявляет биологическую активность при физиологических условиях (температура и рН). Денатурация белков— изменение нативной конформации белковой молекулы под действием различных дестабилизирующих факторов. Аминокислотная последовательность белка не изменяется. Приводит к потере белками их естественных свойств (растворимости, гидрофильности и др.).
ДЕНАТУРАЦИЯ - это лишение белка его природных, нативных свойств, сопровождающееся разрушением четвертичной (если она была), третичной, а иногда и вторичной структуры белковой молекулы, которое возникает при разрушении дисульфидных и слабых типов связей, участвующих в образовании этих структур. Первичная структура при этом сохраняется, потому что она сформирована прочными ковалентными связями.
Ренатурация (от лат. re — приставка, означающая повтор действия и natura — природа) — процесс, обратный денатурации, при котором белки возвращают свою природную структуру. Белки выполняют свойственные им функции только при физиологических условиях (оптимальная температура, рН, концентрация солей и т.п.) При воздействии различных физических (температура выше 60 0 С, высушивание, ультразвук, ультрофиолетовое излучение и др.) и химических (крепкие кислоты и щелочи, мочевина, соли тяжелых металлов, дубильные вещества и др.) факторов белки сравнительно легко изменяют нативную структуру макромолекул, теряя при этом ряд своих первоначальных свойств, и прежде всего, растворимость и биологическую активность. это явление получило название денатурации.
|
|
|
Обратимость денатурации
В пробирке (in vitro) чаще всего это – необратимый процесс. Если же денатурированный белок поместить в условия, близкие к нативным, то он может ренатурировать, но очень медленно, и такое явление характерно не для всех белков.
In vivo, в организме, возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации. Такие специфические белки известны как «белки теплового шока» или «белки стресса». Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.
ПРИМЕР В МЕД.ПРАКТИКЕ
При действии солей тяжелых металлов происходит денатурация белковой молекулы. Осаждение денатурированного белка происходит из-за адсорбции частиц металла на поверхности белковой частицы. Свойства белков осаждаться солями тяжелых металлов используется в медицинской практике. Белки (в составе молока, яйца) применяют в качестве противоядия при отравлении солями тяжелых металлов. Белок ограничивает всасывание ионов металла, образуя с ними нерастворимые комплексы.)
Вопрос 9
Высаливание – это добавление растворов нейтральных солей (Na2SO4, (NH4)2SO4). Анионы (SO4 2–) и катионы (Na+, NH4 +) взаимодействуют с зарядами белка (группы NH4 + и COO–). В результате заряд исчезает, и соответственно, исчезает взаимоотталкивание молекул. Одновременно резко уменьшается гидратная оболочка. Это ведет к "слипанию" молекул и осаждению. Так как белки плазмы крови отличаются по размерам, заряду, строению, то можно подобрать такие количества соли, которые вызовут осаждение менее устойчивых белков, пока другие еще будут растворены.
|
|
|
Диализ. Используют диализную мембрану, которая является полимером и имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей.
Электрофорез. Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда. Носителями для электрофореза могут служить бумага, крахмал, ацетатцеллюлоза, агар и другие гели. Методом электрофореза можно разделить белки и по молекулярной массе. Тогда его проводят в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na).
Осаждение белков органическими растворителями. Из органических растворителей наиболее часто используются ацетон и этанол, которые смешиваются с водой в любых соотношениях. Добавление этих растворителей к водным растворам белков приводит к уменьшению диэлектрической проницаемости растворителя и изменению конформации белковых макромолекул. По мере возрастания концентрации органических растворителей снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул белка. Растворитель связывает воду, вызывая дегидратацию молекул белка и неустойчивость их в раствореВблизи изоэлектрической точки белков осаждение происходит при более низкой концентрации органического растворителя. Крупные молекулы агрегируют быстрее, чем мелкие.
Изоэлектрическое осаждение белков. Большинство ферментов хорошо растворимо при физиологических концентрациях солей, ионной силе 0,15-0,2 М и нейтральном значении рН.
Растворимостьможно рассматривать как результат полярного взаимодействия растворенного вещества с водным растворителем и ионных взаимодействий его с присутствующими солями, а также в некоторой степени как результат электростатического отталкивания между одноименно заряженными молекулами или небольшими (растворимыми) агрегатами молекул. Например, если поверхность глобулы характеризуется высокой гидрофобностью, то это значит, что лишь малая ее часть взаимодействует с растворителем и соответственно меньшее число заряженных групп реагирует с солями. Если заряд снижается до нуля, электростатическое отталкивание уменьшается и по мере приближения к изоэлектрической точке молекулы притягиваются друг к другу с образованием крупных агрегатов. Этот процесс называется изоэлектрическим осаждением.
|
|
|
Методы фракционирования белков основаны на их различиях в растворимости в воде, изменении гидродинамического радиуса, подвижности в зависимости от молекулярной массы и степени ионизации белковой молекулы. К ним относятся такие методы, как высаливание, осаждение органическими растворителями и изоэлектрическое осаждение.Белковая молекула в растворе удерживается двумя факторами – зарядом и гидратной оболочкой. При устранении этих обоих факторов устойчивости белки осаждаются.
По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворителя. В частности, температура замерзания ее составляет –40°С. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (концентрированных растворов нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов, органических растворителей) наблюдается дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок. На этом принципе основаны методы высаливания и осаждения органическими растворителями.
|
|
|
