 |
Техника микроскопирования бактериальных аппаратов
|
|
|
|
Сущность окраски бактерий по Граму
Окраска по Граму позволяет дифференцировать бактерии по химическому составу и структуре клеточной стенки. Метод был разработан датским ученым Христианом Грамом в 1885 г. По окраске по методу Грама все бактерии делятся на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные. Микроскопическая картинка: грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - розовый цвет.
Методика окраски по Граму
1) На фиксированный мазок наносят фильтровальную бумагу, пропитанную раствором генцианвиолета, смачивают ее водой и выдерживают в течение 1-2 минуты
2) Удалить фильтровальную бумагу, слить краску и, не промывая препарат водой, налить на мазок раствор Люголя (раствор йодида и йода) до почернения (в течение 1-2 мин.)
3) Сливают раствор Люголя и на мазок наливают 96 %- й этиловый спирт на 30-40 секунд
4) Тщательно промывают водой
5) Дополнительно окрашивают фуксином Пфейффера в течение 1-2 минут
6) Сливают краску, промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Краски и красящие растворы.
цель окраски- сделать микроорганизмы хорошо видимыми 
Методы исследования м/о в живом состоянии
Методы выявления капсул бактерий
Споры бактерий. Методы окраски спор
При неблагоприятных условиях развития некоторые бактерии переходят в покоящуюся стадию - споры (эндоспоры). К образованию спор способны, как правило, грамположительные, палочковидные бактерии родов Bacillus и Clostridium. Существуют кокки, также образующие эндоспоры (споросарцины).
Спорообразование - это сложный процесс, протекающий в течение нескольких часов (6...24 ч).
|
|
|
Окраска спор. При окраске бактерий простым методом или методом Грама споры не прокрашиваются, т.к. многослойная и очень прочная оболочка споры не воспринимает краски. В связи с этим применяются специальные методы, основанные на предварительном протравливании спор различными кислотами, щелочами, перекисью водорода, а затем окрашивание концентрированными растворами красок, иногда с подогревом. Метод Ауески, метод Миллера, метод Шеффер-Фултона.
Методы стерилизации.
Стерилизация (с греч. Sterilis - бесплодный) - полное уничтожение вегетативных форм м/ов и их спор в различных материалах. Стерилизацию широко используют в пищевой промышленности (мясной, молочной, рыбной) при производстве консервов.
Существуют различные методы стерилизации:
1) Физические методы.
Чаще всего стерилизацию проводят путем воздействия высокой температуры, т.е. термическими методами, которые подразделяют на сухие и влажные.
А) сухая стерилизация
Прокаливание на огне, или фламбирование - очень быстрый, просто и достаточно надежный способ стерилизации. Применяется для стерилизации бактериальных петель, препаровальных игл, шпателей, пинцетов, скальпелей, предметных стекл и др.непосредственно перед их использованием. Для стерилизации обрабатываемый предмет несколько раз проводят через пламя спиртовки или газовой горелки. Стерилизация сухим жаром проводится в сушильном шкафу (печи Пастера). Сушильные шкафы широко используются в бактериологической лаборатории для стерилизации стеклянной посуды, пипеток, чашек Петри.
Б) влажная стерилизация
Кипячение - для стерилизации металлических инструментов, шприцев, игл в течене 10-30 мин. При кипячении погибают вегетативные формы бактерий и споры некоторых бацилл. Однако споры анаэробных клостридий (С. sporogenes, C. botulinum, C.perfringens), а также некоторых бацилл (Bac.subtilis) остаются живыми,т.к. они выдерживают кипячение более 3 ч.
|
|
|
Стерилизация паром под давлением (автоклавирование) - самый эффективный и надежный в бактериологической практике способ стерилизации, при котором достигается полное обеспложивание и гибель вегетативных и споровых форм.Стерилизация насыщенным паром под давлением проводится в паровых стерилизаторах (автоклавах) - специальные герметически закрывающиеся аппараты с толстыми стенками. Автоклав состоит из стерилизационной камеры, снабженной краном для выхода воздуха, манометром для изменения давления пара, предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления выше необходимого, термометра для изменения температуры внутри камеры. Стерилизацию материала (посуда, инструменты, питательные среды, кроме сыворочных, белковых и углеводных сред, а также стерилизуют перевязочный материал, культуры м/ов) в автоклаве чаще проводят при температуре 121 0С в течение 15-45 мин.
Дробную стерилизацию, или стерилизацию текучим паром, подвергают такие материалы, которые портятся или разлагаются при стерилизации под давлением. Дробную стерилизацию проводят в текучепаровых аппаратах (аппаратах Коха) или автоклаве с открытым краном.
Тиндализация - это дробная стерилизация при t ниже 1000С, предложенная франц.ученым Тиндалем для питательных сред, свойства которых изменяются при более высоких t; проводится в течение 5 дней подряд при t 60-65 0C по 1 час ежедневно или при 70-80 0С в течение 3 дней в специальных пробирках с терморегулятором или на водяных банях. В промежутках между подогреванием в стерилизуемой жидкости, хранящейся в термостате, споры, прорастая в вегетативные формы, погибают при последующем нагревании.
Пастеризация - это термическая обработка продуктов при t ниже 1000C с последующим охлаждением до 10-12 0С, предложенная Л.Пастером. при пастеризации погибают неспоровые микроорганизмы, снижается общая бактериальная обсемененность и повышается стойкость продукта. Быстрое охлаждение после стерилизации необходимо для предотвращения прорастания спор в вегетативные клетки. Пастеризацию проводят при производстве молока. Вин, икры, фруктовых соков, вареных колбасных изделий и др.продуктов. Существует три режима пастеризации: длительная (при t 63-70C, 20-40 мин), кратковременная (быстрая) при 75-80С 5-10 мин, моментальная при 90-98С в течение нескольких секунд.
|
|
|
К физическим методам стерилизации также относят стерилизацию ультрафиолетовыми лучами, радиоактивными излучениями, радиоволнами, ультразвуком, а также ионизацию, инфракрасные лучи и др
2) Механические методы. К ним относят стерилизацию фильтрованием. Фильтрование - механическая стерилизация жидкостей, которых нельзя подвергнуть нагреванию (сыворотка, белок, витамины, антибиотики и др) для фильтрации в микробиологии применяют асбестовые, фарфоровые, глиняные и другие фильтры и свечи, а также мембраны. В практике механическую стерилизацию проводят через специальные фильтрование приборы (фильтры Зейтца), имеющие настолько мелкие поры, что на своей поверхности задерживают все механические, взвешенные в жидкости частицы, в том числе и микробы.
3) Химические методы. Химическая стерилизация имеет ограниченное применение. В лабораторной практике применяют некоторые химические в-ва, такие как толуол, хлороформ, эфир и другие, для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред. Для освобождения от консерванта среду нагревают на водяной бане при 56С. Для дезинфекции в лабораториях применяют раствор хлорамина 1-3%-й, фенола 3-5% -й и др.
|
|
|
