1. Обнаружение возбудителя

Для предотвращения отправки как животных, так и производных от животных (особенно спермы и эмбрионов), инфицированных ВВД КРС, необходимо провести тестирование на наличие инфекционного вируса (выделение вируса), вирусных антигенов (ИФА для обнаружения антигена) или РНК (ОТ-ПЦР в реальном времени) в крови отправленного животного или донора идиоплазмы (сперма или эмбрион). Исключение составляют серопозитивные быки, когда необходимо тестировать сыворотку, а не быка-донора. Серология имеет значение только для определения того, что серонегативные животные не имеют острой инфекции или для установления серологического статуса быков-доноров. Из-за их различной чувствительности без предшествующей амплификации вируса, такие процедуры как иммуногистохимия или in situ гибридизация напрямую на тканевых культурах не считаются подходящими для сертификации относительно свободы от ВВД КРС в целях международной торговли. Для сравнения, иммуноокрашивание является важным компонентом выделения вируса в клеточной культуре для обнаружения наличия нецитопатических штаммов ВВД КРС, превалирующих в полевых инфекциях.

Все методы тестирования должны быть тщательно валидированы посредством тестирования известных неинфицированных или инфицированных популяций с виремиями с высоким и низким титром. Необходимо продемонстрировать методы, основанные на анализе связывания поликлональных или моноклональных антител (ИФА или иммуногистохимия), методе иммунной метки (выделение вируса) или методе распознавания нуклеиновой кислоты, для обнаружения полного диапазона антигенного и генетического разнообразия, обнаруженного среди вирусов вирусной диареи КРС. Существуют три назначенные референтные лаборатории МЭБ по ВВД КРС, которые могут помочь с предоставлением соответствующей информации (смотрите список в Части 4 Руководства по наземным животным); к референтным лабораториям по классической чуме свиней можно также обращаться за консультацией.

 1. 1. Выделение вируса

При выполнении в соответствии с высокими стандартами метод выделения вируса вирусной диареи КРС является очень надежным. Однако данный метод имеет очень строгие требования для обеспечения того, чтобы клеточные культуры и компоненты среды представляли систему, которая является очень чувствительной и присутствие как низких уровней антител специфичных к ВВД КРС, так и вируса, не оказывает на нее отрицательного воздействия. Выделение вируса имеет потенциал обнаружения инфекционного вируса, что накладывает определенные ограничения на качество образца. Далее, для определения низких уровней вируса, который может присутствовать в некоторых образцах, особенно спермы, может быть необходимо исследовать большие объемы образца, чем обычно. Некоторые из этих ограничений можно преодолеть посредством использования ИФА для обнаружения антигена с доказанной высокой аналитической чувствительностью или посредством использования ОТ-ПЦР в реальном времени.

Вирус можно выделить в нескольких бовиных клеточных культурах монослоя (например, почки, легкие, семенники или носовые раковины). В некоторых случаях подходят клетки овечьих). Первичные и вторичные культуры можно заморозить как клеточные суспензии в жидком азоте. Их можно исследовать в серии пассажей или их можно высеять на другие восприимчивые клетки и проверить на свободу от контаминантов и провести оценку их чувствительности в сравнении с разрешенной серией клеток перед плановым использованием. Такие проблемы можно сократить за счет использования перевиваемых клеточных линий, которые являются свободными от ВВД КРС, однако, их статус свободы от ВД КРС и восприимчивость необходимо регулярно контролировать. Перевиваемые клетки нужно использовать в рамках системы «посевной серии клеток», где они используются только в ограниченном диапазоне пассажей, внутри которого они продемонстрировали приемлемую чувствительность к инфицированию ВВД КРС. Хотя определенные перевиваемые клеточные линии считаются подходящими для использования для выделения ВВД КРС, между сериями клеток из разных источников может быть значительное разнообразие из-за различных историй пассажей, поэтому их соответствие должно быть подтверждено перед плановым использованием.

Нецитопатический ВВД КРС является распространенным контаминантом тканей КРС и клеточные культуры необходимо проверять на свободу от занесенного вируса посредством проведения регулярного тестирования. Клетки должны расти в доказанных компонентах среды культуры клеток и необходимо исследовать большую площадь клеток. Не допустимо проводить скрининг нескольких лунок 96-луночного планшета – исследование всех лунок 96-луночного планшета будет более убедительным доказательством свободы. Фетальная бовиная сыворотка, которую отбирают для использования в клеточной культуре, также должна быть свободна не только от вируса, но в равнозначной, а то и большей степени, от ВВД КРС нейтрализующего антитела. Термическая обработка (56º в течение 30-45 минут) является неадекватной для уничтожения ВВД КРС в контаминированной сыворотке; облучение дозой равной, по крайней мере, 25 килогрей (2, 5 мрад) является более точным. Коммерческие серии фетальной бовиной сыворотки обычно демонстрируют положительные результаты тестирования при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени даже после того, как вирус был инактивирован посредством инактивации. Далее, большинство коммерчески отобранных серий фетальной бовиной сыворотки содержат антитела к пестивирусам, иногда на уровнях, которые являются едва обнаружимыми, но достаточными для ингибирования выделения вируса. Чтобы преодолеть это, сыворотку можно получать из вируса ВД КРС и животных доноров без антител и с уверенностью использовать. Тестирование доноров, как на вирус, так и на антитела проходит на отдельном животном. Хотя лошадиная сыворотка была заменена на бовиную фетальную сыворотку, очень часто она имеет плохие характеристики, способствующие росту клеток. Далее иногда наблюдалась перекрестная контаминация с фетальной бовиной сывороткой во время обработки, что сводило к нулю задачу получения продукта, свободного от вируса ВД КРС.

Лейкоцитарные клетки, цельная кровь, отмытые лейкоциты или сыворотка подходят для выделения вируса от живых животных. Материнское антитело может помешать в процесс выделения из сыворотки молодых телят.

Тканевые суспензии, полученные от животных при вскрытии, нужно готовить с использованием стандартных методов. Подтверждение того, что бык не является персистентно инфицированным ВВД КРС в основном без затруднений достигается посредством тестирования образцов крови. Однако персистирующие тестикулярные инфекции (PTI) были обнаружены у некоторых быков, которые выздоровели от острой инфекции, больше не являются виремическими и теперь серопозитивны (Voges et al., 1998). Вирус можно обнаружить в большинстве, но во всех коллекциях спермы от этих быков. Хотя это пока еще считается нераспространенным, чтобы исключить возможность наличия PTI необходимо провести скрининг спермы от всех серопозитивных быков. Чтобы быть уверенным в том, что бык свободен от PTI, серии спермы, отобранной в течение нескольких недель необходимо подвергнуть скринингу. После скрининга серии отобранной спермы дальнейшее тестирование спермы серопозитивного быка не гарантировано. Свежая сперма и иногда разбавленная сперма является цитотоксичной и должна быть разведена в культуральной среде. По этим причинам важно контролировать здоровье клеток посредством макроскопического исследования в интервалы во время инкубации. Эти проблемы можно преодолеть посредством использования ОТ-ПЦР в реальном времени, которая имеет много преимуществ по сравнению с методом выделения вируса, включая более высокую чувствительность и возможность завершения в течение нескольких часов, а не недель, что характерно для выделения вируса.

Существует много вариантов процедуры использования метода выделения вируса. Все они должны быть оптимизированы, чтобы обладать максимальной чувствительностью обнаружения стандартного вирусного препарата. Все биологические компоненты, используемые для клеточной культуры, должны быть подвергнуты скринингу и должны продемонстрировать отсутствие как ВВД КРС, так и антител к ВВД КРС. Клеточные культуры (как исходные, так и перевиваемые клеточные линии) нужно регулярно проверять для подтверждения того, что они сохраняют максимальную восприимчивость к инфицированию вирусом. В зависимости от типа образца и цели тестирования, метод выделения вируса, вероятно, требует проведения одного или более пассажей на клеточных культурах. В то время как персистентно инфицированных животных можно легко идентифицировать посредством скрининга крови или сыворотки в одном пассаже, сперму необходимо культивировать для трех пассажей на плановой основе, а биологические продукты, такие как фетальная бовиная сыворотка - до пяти раз (первичная инокуляция плюс четыре пассажа). Используются традиционные методы выделения вируса с добавлением конечного этапа иммуно-окрашивания (иммунофлуоресценция или чаще окрашивание пероксидазой) для обаружения рост нецитопатического вируса. Эти культуры в пробирках должны иметь съемное покрывное стекло, в то время как культуры в микропланшетах должны быть зафиксированы и помечены прямо в планшете. Примеры приведены ниже. В качестве альтернативы супернатант клеточной культуры от конечного пассажа может быть подвергнут скринингу посредством ОТ-ПЦР в реальном времени (Смотрите ниже).