 |
1.1.2. Метод пробирок для ткани или суспензий из лейкоцитарных пленок
|
|
|
|
1. 1. 2. Метод пробирок для ткани или суспензий из лейкоцитарных пленок
N. B. Данный метод может быть адаптирован в 24-луночной пластмассовой чашке. Обратите внимание, что требуется минимум проведение 2 и предпочтительнее 3 пассажа (включая первоначальную инокуляцию).
i) Образцы тканей измельчают и готовят 10% суспензию в культуральной среде. Затем ее центрифугируют для удаления осадка.
ii) В тестовые культуры в пробирках с новыми конфлюэнтными или субконфлюэнтными монослоями восприимчивых бовиных клеток инокулируют 0, 1 мл образца. Культуру оставляют для адсорбции на один час при температуре 37º С.
iii) Культуру промывают 1мл среды; затем ее сливают и добавляют 1 мл культуральной поддерживающей среды.
iv) Культуру инкубируют в течение 4-5 дней при 37º С и исследуют под микроскопом на наличие ЦПД или признаков цитотоксичности.
v) Культуру нужно заморозить и оттаять для пассажей на клеточные культуры для проведения предпочтительно двух и более пассажей (включая культуру, инокуллированную для окончательного иммуно-окрашивания). При окончательном пассаже после замораживания-оттаивания тканевую культуральную жидкость собирают и пассируют на микротитровальные планшеты для культивирования и окрашивания методом иммунопероксидазы (смотрите раздел В. 3. 1. 1 выше) или посредством метода иммунофлуоресценции. Для проведения иммунофлуоресценции покровные стекла включены в пробирки и используются для поддержки культуральных сред. В конце периода культивирования покровные стекла удаляют, фиксируют в 100% ацетоне и окрашивают иммунофлуоресцентым конъюгатом к ВВД КРС. Покрывные стекла исследуют под флуоресцентным микроскопом на наличие диффузии, цитоплазмических флуоресцентных характеристик пестивирусов. В качестве альтернативы можно провести скрининг супернатанта культуры от последнего пассажа посредством ОТ-ПЦР в реальном времени (смотрите ниже).
|
|
|
1. 1. 3. Выделение вируса из спермы
Обычно образцы, используемые для исследования, это разбавленная сперма КРС или иногда свежая сперма. Образцы спермы должны транспортироваться в лабораторию в жидком азоте или на сухом льду. Образцы необходимо хранить в жидком азоте или при температуре ниже - 70º С (для длительного хранения) или 4º С (для кратковременного хранения в течение не более 1-2 дней). Лаборатория-получатель должна зарегистрировать условия, в которых были получены образцы. Свежая сперма обычно цитотоксична и ее необходимо предварительно разбавить (например, в 1/10 бовинной сыворотке, свободной от ВВД КРС) перед добавлением в клеточные культуры. Необходимо провести тестирование, по крайней мере, 0, 1 мл свежей спермы, посредством трех пассажей в клеточной культуре. В разбавленной сперме можно обнаружить токсичность. Что касается разбавленной спермы необходимо провести приблизительную оценку, чтобы удостовериться в том, что 0, 1 мл свежей спермы подвергается тестированию (например, 1, 0 мл разбавленной спермы). Если наблюдается токсичность, может потребоваться тестирование проб, разбавленных несколько раз, для получения объема, эквивалентного 0, 1 мл свежей спермы (например, 5× 1 мл образца разбавленной
спермы, которая была разведена 1/5 для снижения токсичности). Предлагаемый метод состоит в следующем:
i) Развести 200 мкл свежей спермы в 1, 8 мл бовиной спермы, содержащей антибиотики. Это может быть та же сперма, которая использовалась для добавления к клеточной культуре и она должна быть свободной от антител к ВВД КРС.
ii) Интенсивно перемешать и оставить на 30 минут при комнатной температуре.
|
|
|
iii) Иннокулировать 1 мл спермы/смеси спермы в монослой восприимчивых клеток (смотрите метод выделения вируса из ткани выше) в пробирки для культуры клеток или шестилуночные планшеты для культивирования тканей.
iv) Инкубировать культуры в течение 1 часа при температуре 37º С.
v) Удалить смесь, промыть монослой несколько раз стабилизирующей средой и затем добавить стабилизирующую среду к культурам.
vi) Включить отрицательные и положительные контроли ВВД КРС в тест. Особое внимание необходимо уделить тому, чтобы избежать случайной контаминации лунок положительным контролем, например, работая с положительным контролем в последнюю очередь.
vii) Осуществлять наблюдение планшетов с использованием микроскопа для обеспечения свободы от контаминации и цитотоксичности. В результате инфицирования вирусом ВД КРС не должно наблюдаться цитопатологии, но другие вирусы, такие как BHV-1 могут быть выделены случайно.
viii) Через 5-7 дней культуры замораживают при температуре ниже –70º С и оттаивают, очищают посредством центрифугирования и супернатант используется для инокуляции свежих монослоев.
ix) В конце второго пассажа супернатант от замороженного-оттаявшего препарата нужно пассировать на культуры в подходящей системе для иммунопероксидазного окрашивания или другого метода обнаружения антигена или посредством ОТ-ПЦР в реальном времени через 5 дней культивирования. Это легко достигается в 96 луночных планшетах. Образец считается отрицательным, если нет доказательств наличия вирусного антигена или не обнаружена РНК ВВД КРС.
1. 2. Обнаружение нуклеиновой кислоты
ОТ-ПЦР на традиционном геле в прошлом использовался для обнаружения вирусной РНК ВД КРС для диагностических целей. Мультиплексная ОТ-ПЦР использовалась для одновременной амплификации и типирования вируса из клеточной культуры или прямо из образцов крови. Однако, ОТ-ПЦР, основанная на геле имеет недостаток, который состоит в том, что она является трудозатратной, дорогой и при ее проведении возможна перекрестная контаминация. Эти проблемы значительно уменьшились после внедрения методов в реальном времени с использованием зондов, методов количественной ОТ-ПЦР. Тем не менее необходимо предпринять строгие меры предосторожности во избежание контаминации нуклеиновой кислоты в тест-системе и помещениях лаборатории, где работают с образцами и где их подготавливают (смотрите главу 1. 1. 6. Принципы и методы валидации диагностических тестов для инфекционных болезней и Главу 3. 6. 3. Разработка и оптимизация тестов для обнаружения нуклеиновой кислоты). Эти тесты имеют гораздо большую чувствительность, чем ОТ-ПЦР с использованием геля и могут быть завершены в течение нескольких часов. Они широко используются для диагностики инфекционных заболеваний, позволяя напрямую обнаружить вирусную РНК из широкого диапазона образцов, включая сыворотку, цельную кровь, ткани, молоко и сперму. Высокая аналитическая чувствительность позволяет принять стратегии для скрининга пулов отдельных образцов и проводить тестирование сборного молока. Посредством использования данного подхода можно идентифицировать наличие одного или нескольких персистентно инфицированных животных в стадах, содержащих несколько сотен коров. Несмотря на то, что ОТ-ПЦР является немного более дорогим методом, этот метод считается быстрым и надежным и может использоваться также для скрининга супернатанта из последнего пассажа культур клеток. Несмотря на то, что ОТ-ПЦР в реальном времени имеет высокую чувствительность и может применяться для скрининга биологических материалов, используемых для производства вакцин, необходимо внимательно интерпретировать результаты, так как обнаружение вирусной РНК само по себе не подразумевает, что присутствует инфекционный вирус. Методы ОТ-ПЦР в реальном времени основаны на зонды ДНК, меченые флуоресцином также может быть использован для дифференциации пестивирусов (e. g. McGoldrick et al., 1999).
|
|
|
Праймеры для теста должны быть отобраны из высоко консервативных областей генома, в идеале 5’-некодирующейобласти, или NS3 (p80 гена). Существуют опубликованные тесты, которые являются широко реактивными в роде пестивирусов и обнаруживают все типы ВВД КРС, вирус КЧС и большинство атипичных пестивирусов (например, Hoffman et al., 2006). Чувствительный высоко-реактивный тест рекомендуется для диагностики, так как иногда встречается межвидовая передача различных пестивирусов. Когда требуется дальнейшая идентификация специфического вируса, видоспецифичные тесты на пестивирусы могут применяться для дальнейшего типирования вирусов. Важно тщательно оптимизировать все аспекты ОТ-ПЦР в реальном времени, включая экстрагирование нуклеиновой кислоты и очистку. Необходимо определить оптимальные концентрации Mg2+, праймеров, зонда и полимеразы и параметры цикла. Однако, полностью составленные и оптимизированные, готовые к использованию «мастермиксы» теперь доступны в продаже и требуют только добавления оптимизированных концентраций праймеров и зонда.
|
|
|
Для определенного мастермикса часто рекомендуют оптимизированные условия цикла.
Разнообразные коммерчески доступные системы очистки нуклеиновой кислоты имеются в форме наборов и некоторые могут быть полуавтоматическими. Системы, основанные на захвате и очищении РНК с использованием магнитных микроносителей, используются достаточно широко и позволяет осуществить быструю обработку большого количества образцов. Необходимо провести оценку специфичных продуктов для определения оптимального набора для определенного типа образцов и того, требуется ли предварительная обработка образцов. Для образцов цельной крови важен тип антикоагулянта и объем крови в пробирке с образцом. Больше проблем с ингибиторами реакции ПЦР наблюдается с образцами, собранными в кровь, обработанную гепарином, а не ЭДТА. Эти различия также усугубляются, если пробирка не содержит рекомендованный объем крови, таким образом, увеличивая концентрацию антикоагулянта в образце. Для идентификации возможных ложно-положительных результатов рекомендуется внести эгзогенную матрицу РНК (внутренний контроль) в образец до экстрагирования РНК (Hoffman et al., 2006). Посредством включения праймеров ПЦР и зонда специфичного для эгзогенной последовательности можно контролировать как эффективность РНК экстрагирования, так и наличие любых ингибиторов ПЦР. Будучи ценным для всех типов проб, включение внутреннего контроля является особенно желательным. При использовании внутреннего контроля необходимо проведение комплексных испытаний для обеспечения того, что амплификация внутреннего контроля в ПЦР не конкурирует с диагностической ПЦР и таким образом понижает аналитическую чувствительность (смотри также главу 1. 1. 6).
Когда имеется подозрение, что проба может содержать вещества, которые негативно влияют как на эффективность экстрагирвания РНК или ОТ-ПЦР в реальном времени, небольшое разведение пробы в физиологическом растворе, культуральной среде или буферном растворе (например, PBGS) обычно помогает решить проблему. Разведение образца спермы на ¼ и цельной некоагулированной крови на 1/10 обычно достаточно. Так как у ОТ-ПЦР в реальном времени обычно очень высокая аналитическая чувствительность, разведение образца редко оказывает значительное влияние на способность теста обнаруживать вирусную РНК при ее наличии.
|
|
|
