 |
1.1.1. Иммунопероксидазный метод в микропланшетах для массового скрининга для обнаружения вируса в образцах сыворотки (Meyling, 1984)
|
|
|
|
i) 10-25 мкл образца сыворотки помещают в каждую из четырех лунок 96-луночного микропланшета для культивирования культур. Эту процедуру необходимо повторить для каждого образца. Включены известные положительные и отрицательные контроли
ii) 100 мкл клеточной суспензии в соответствующей концентрации (обычно около 150000клеток/мл) в среде без фетальной телячьей сыворотки добавляют во все лунки: Примечание: сам образец действует в качестве обогатителя для роста клеток. При тестировании образцов за исключением сыворотки, используйте среду с фетальной телячьей сывороткой, свободной от антител к пестивирусам жвачных.
iii) Планшет инкубируют при температуре 37º С в течение четырех дней либо в 5% СО2 атмосфере или планшет герметично закрывают.
iv) Каждую лунку исследуют под микроскопом на наличие цитопатологии (цитопатическое действие или ЦПД) или признаков цитотоксичности.
v) Культуры быстро замораживают при температуре приблизительно -80º С и 50 мкл культурального супернатанта пассируют в новые клеточные культуры, повторяя этапы 3. 1. 1. i-iv, указанные выше.
vi) Клетки фиксируют и окрашивают с применением одного из двух методов:
Параформальдегид
a) Добавьте 200 мкл 1/10 разведения раствора формальдегида (приблизительно 3% концентрацию) в планшет и оставьте при комнатной температуре на 10 минут.
b) Затем содержание планшета сбрасывают и планшеты промывают.
c) Промойте планшет 5 раз с использованием 0, 05% Твин 20 в воде (может быть использована автоматическая мойка микропланшетов с низким давлением и регулированием скорости)
d) В каждый планшет добавьте 50 ul противовирусного антитела в соответствующем разведении (приготовленном в фосфатно-буферном растворе/ФБР, содержащем 1% желатина) и инкубируйте в течение 60-90 минут при температуре 37º С во влажной камере.
|
|
|
e) Промойте планшеты пять раз как в этапе с).
f) Разведите соответствующую антисывортку, конъюгированную пероксидазой, до оптимального разведения в 1% желатине/ФБР (например, кроличий
антимышиный иммуноглобулин, конъюгированный пероксидазой, когда противовирусное антитело является мышиным моноклональным антителом). Оптимальную концентрацию нужно определять для каждой партии конъюгата посредством титрования в шахматном порядке на референтных положительных и отрицательных контролях.
g) В каждую лунку микропланшета добавьте 50 ul разведенного конъюгата пероксидазы и инкубируйте в течение 90 минут при температуре 37º С во влажной камере.
h) Промойте планшеты 5 раз, в соответствии с процедурой, изложенной в этапе с).
i) «Подготовьте» планшет, добавив 3-амино-9-этил карбазол (AEC) и оставьте на 30 минут при комнатной температуре, чтобы произошла реакция.
j) Добавьте 100 ul ФБР в каждую лунку и каждый планшет закройте крышкой.
k) Исследуйте лунки под микроскопом, начиная с лунок с положительным и отрицательным контролями. В неинфицированных клетках (отрицательный контроль) не должно быть или должно быть минимальное окрашивание. Инфицированные (положительный контроль) клетки должны быть красно-коричневого цвета в цитоплазме.
Ацетон
a) Планшет опустошают, осторожно перевернув его и споласкивают в ФБР.
b) Клетки фиксируют следующим образом: планшет помещают в ванну с 20% ацетоном в ФБР, немедленно опустошают и затем переносят в свежую ванну с 20% ацетоном в ФБР на 10 минут. Содержимое планшета тщательно сливают и как можно большее количество жидкости удаляют посредством слива и промокания. Планшет тщательно сушат в течение, по крайней мере, трех часов при температуре 25-30º С (например, используя лучистое излучение от настольной лампы). NB: сушка является частью процесса фиксации.
|
|
|
c) Зафиксированные клетки ополаскивают, добавляя ФБР во все лунки.
d) Лунки осушают и во все лунки добавляют антитело ВД КРС (50 мкл) в предустановленном разведении в ФБР, содержащем 1% Твин 80 (ФСБТ) и 5% лошадиную сыворотку или 1% желатин. (Лошадиную сыворотку
или желатин можно добавлять для уменьшения неспецифического окрашивания).
f) Инкубируйте при температуре 37º С в течение 15 минут.
g) Вылейте содержание планшетов и промойте три раза в (ФСБТ).
h) Осушите планшет и добавьте соответствующую анти-видовую сыворотку, конъюгированную с пероксидазой, в предопределенном разведении в ФСБТ (50 мкл на лунку) в течение 15 минут при температуре 37º С.
i) Опустошите планшеты и промойте три раза в ФСБТ.
j) Ополосните планшет в дистиллированной воде. Всю жидкость удаляют из планшета промоканием.
k) Добавьте свеже приготовленный субстрат перекиси водорода с подходящим хромогеном, например, 3-амино-9-этил карбазол (AEC). Можно приготовить альтернативный субстрат, состоящий из 9 мг диаминобензанилида тетрагидрохлорила и 6 мг тетрагидрата пербората натрия, растворенного в 15 мл ФБР. Хотя окрашивание не такие интенсивное, эти химические вещества имеют преимущество, т. к. их можно транспортировать на воздушных средствах.
l) Планшет исследуют под микроскопом. Вирус-положительные клетки демонстрируют красно-коричневое окрашивание.
Могут использоваться альтернативные методы фиксации клеток и они включают использование высоких температур (Смотри Главу 2. 8. 3. Классическая чума свиней, Раздел В. 2. 2. 1. viii). Сначала их необходимо валидировать чтобы убедиться, что способности обнаруживать вирусный антиген ничего не угрожает.
|
|
|
