 |
Рис. 24 Принцип секвенирования ДНК на основе метода MALDI-TOF
|
|
|
|
Рис. 24 Принцип секвенирования ДНК на основе метода MALDI-TOF
Заряженные молекулы ДНК в газовой фазе под действием высокого напряжения ускоряются в электрическом поле и попадают на детектор. Затем проводят повторный раунд расщепления и определения масс более мелких фрагментов. На основании полученных данных может быть вычислена масса анализируемой молекулы и расшифрована последовательность сравнительно короткого гомогенного фрагмента (Рис. 24).
В настоящее время, метод MALDI-TOF не используется в коммерческих вариантах секвенаторов.
2. 5 Секвенирование лигированием (принцип комплементарности цепей ДНК)
Современные методы секвенирования лигированием основаны на использовании коллекции коротких (как правило от 8 до 10 оснований) флуоресцентно-меченных с помощью четырех красителей вырожденных олигонуклеотидов, так, что каждому флуорофору соответствует определенный нуклеотид (или два) в определенной позиции.
Сначала создают иммобилизованную на твердой фазе клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК (например методом капельной ПЦР). Секвенирование начинают с отжига праймера, комплементарного адаптеру на одном из концов библиотеки ДНК. Затем к библиотеке добавляют флуоресцентно-меченные вырожденные олигонуклеотиды и проводят реакцию лигирования, что приводит к фиксированию олигонуклеотида на фрагменте в случае его полного соответствия. Затем считывают флуоресценцию, определяя тем самым, какой нуклеотид (или пара нуклеотидов) находится в определенной позиции. Флуорофор удаляют и лигируют следующий олигонуклеотид (всего проводят 10 - 15 последовательных лигирований). Затем проводят " перезагрузку" праймера путем его отсоединения с прилигированными меченными олигонуклеотидами и повторяют цикл с другим праймером со сдвигом на одну букву (Рис. 25).
|
|
|
Рис. 25 Секвенирование методом лигирования
В настоящее время, данный принцип секвенирования реализуется в коммерческих технологиях Prolonator (Dover/Harvard) и SOLiD (Life Technologies Thermo Fisher Scientific).
2. 6 Пиросеквенирование (регистрация акта присоединения нуклеотида по образующемуся пирофосфату)
В 1996 г. специалистами Королевского технологического института в Стокгольме Мустафой Рональди и Полом Ниреном был предложен подход к секвенированию ДНК, в основе которого лежит принцип регистрации пирофосфата, образующегося в результате присоединения очередного нуклеотида ДНК-полимеразой. Для детекции выделяющегося в процессе образования фосфодиэфирной связи пирофосфата используется каскад последовательных химических реакций, заканчивающийся высвечиванием кванта света.
Вначале любым методом создают иммобилизованную на твердой фазе клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК (например, методом мостиковой ПЦР). Предварительно, ко всем фрагментам ДНК присоединяют адаптер, на который будет гибридизоваться праймер, служащий затравкой для синтеза комплементарной цепи ДНК-полимеразой. Дальнейшая реакция состоит из последовательных циклов, в процессе которых, к закрепленной на твердой фазе ДНК по очереди добавляют dNTP всех 4-х типов. В случае, если в данной ДНК-колонии на секвенируемой цепи ДНК имеется комплементарный добавленному нуклеотид, в процессе формирования ДНК-полимеразой фосфодиэфирной связи побочным продуктом реакции будет пирофосфат. Он активирует каскад химических реакций, в результате которых возникает световой сигнал, интенсивность которого прямо пропорциональна числу включенных в цепь нуклеотидов.
|
|
|
