 |
Рис. 28 Полупроводниковое секвенирование
|
|
|
|
Рис. 28 Полупроводниковое секвенирование
Как и в случае пиросеквенирования, у полопроводникового секвенирования есть трудности с детекцией гомополимерных участков. В случае протяженного мононуклеотида, например ТТТТТТТТ, сигнал теряет дискретность и определить, сколько именно нуклеотидов присутствует в последовательности становится затруднительно.
Важным отличием полупроводникового секвенирования от других методов является отсутствие оптического детектора сигнала, что значительно упрощает и удешевляет конструкцию прибора. Кроме того, отсутствие необходимости оптической детекции снимает ограничение по количеству микроцентров секвенирования, которые можно разместить на чипе.
На принципе полупроводникового секвенирования основана коммерческая технология IonTorrent, предоставляемая компанией Life Technologies Thermo Fisher Scientific. Разработки в данном направлении ведутся также компанией Roche.
2. 9 Нанопоровое секвенирование
Еще одна оригинальная идея секвенирования была предложена Касьяновичем в 1996 г. Принцип метода заключается в регистрации изменений ионного тока, вызванного прохождением одноцепочечной ДНК через нанопору в тонкой пленке под действием электрического поля (Рис. 29).
Рис. 29 Принцип нанопорового секвенирования.
Проходящая через пору молекула одноцепочечной ДНК или РНК меняет потенциал на мембране.
Поры могут быть естественного биологического происхождения. Например, можно использовать биологическую мембрану с какой-либо порой. Также могут использоваться искусственные поры. Например, поры в виде сенсора для фиксации изменения какой-либо характеристики: туннельного тока, емкости, ионного тока или флуоресценции. При переходе через пору, каждый тип азотистых оснований по-своему " закупоривает" пору и влияет на ток.
|
|
|
В настоящее время данная технология реализована компанией Oxford Nanopore (Великобритания) в устройствах MinION, GridION и PromethION (Рис. 30).
Рис. 30 Приборы для нанопорового секвенирования: секвенаторы MinION (А), GridION (Б) и PromethION
В настоящее время, технологии Nanopore позволяют осуществлять:
- Прямое прочтение нуклеотидных последовательностей цепей ДНК и РНК
- Длина прочтения ограничена только длиной фрагмента.
- Наблюдение за ходом секвенирования в реальном времени дает возможность остановки процесса в любой момент при достаточном накоплении данных, при очевидных ошибках пробоподготовки или других сбоях в работе; интерпретацию сигналов (base calling) и анализ данных можно проводить непосредственно в процессе секвенирования. Технология обеспечивает простой алгоритм сборки, полученных буквенных последовательностей.
В секвенаторе MinION используется ячейка с 512 нанопоровыми каналами, каждый из которых предназначен для анализа отдельной молекулы нуклеиновой кислоты. В сумме прибор позволяет получить до 20 Гб информации о последовательности ДНК. Длина прочтения, ограничена только длиной фрагмента нуклеиновой кислоты и составляет сотни тысяч нуклеотидов. GridION, в отличие от MinION, состоит из пяти проточных ячеек с нанопоровыми каналами, что позволяет проводить пять параллельных независимых экспериментов. Общий объём информации о последовательности ДНК, полученный с помощью секвенатора GridION, может быть до 100 Гб. Методика характеризуется простой пробоподготовкой и возможностью анализировать последовательности любой длины. Секвенатор PromethION пердназначен для высокопроизводительного секвенирования. Прибор включает 24 независимые ячейки, каждая из которых содержит 3000 каналов. При анализе можно задействовать любое количество этих ячеек, в каждой из которых будет проводиться отдельный эксперимент. Анализ результатов происходит с помощью встроенного процессора.
|
|
|
