Рис 34. Принцип генной терапии ex vivo

Рис 34. Принцип генной терапии ex vivo

Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток) гарантирует, что после инфузии или трансплантации у него не разовьется иммунный ответ.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного (Рис. 35). При этом вводимые ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими их адресную доставку в клетки-мишени. В настоящее время этот подход опробирован только для лечения муковисцидоза.

Рис. 35 Принцип генной терапии in vivo

Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких как муковисцидоз, эмфизема, рак легких, при которых объектами генетической модификации являются специфические типы легочных клеток. Инъецируемые вакцины могут использоваться для модификации различных типов клеток и представляют собой наиболее универсальный способ доставки чужеродного генетического материала в любые ткани.

Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. План генотерапевтических вмешательств определяется также доступностью клеток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в организме, эффективностью и специфичностью трансфекции клеток и продолжительностью экспрессии введенного гена.

Наиболее перспективной представляется возможность генетической модификации не самих дифференцированных клеток с наследственным дефектом, а их предшественников - плюрипотентных стволовых клеток.

Определение типа клеток, подлежащих генетической модификации, завершается оценкой результата переноса гена в системе in vitro и проведением экспериментов на животных моделях. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного либо на перевиваемых культурах, полученных после предварительной трансформации первичных культур. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и его коррекции на биохимическом уровне.

Тем не менее, многие проблемы генной терапии не могут быть решены на клеточном уровне. Важное значение имеет анализ влияния введенных ДНК на межклеточные взаимодействия, определяющие работу соответствующих тканей и органов. Такие исследования могут быть проведены только in vivo.

3. 2 Методы генетической трансфекции в генной терапии

Решающим условием успешной генной терапии является обеспечение эффективной доставки, т. е. трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительной персистенции его в этих клетках и создание условий для полноценной экспрессии. Существуют следующие основные подходы к трансфекции клеток:

1) трансфекция " чистой" ДНК, лигированной в соответствующую плазмиду;

2) трансфекция комплексированной ДНК, т. е. - плазмидной ДНК, находящейся в комплексе с солями, белками (например, трансферрином), органическими полимерами (ДЭАЭ-декстраном, полилизином), липосомами или частицами металлов (золото, вольфрам);

3) трансдукция ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации;

Условием длительной персистенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее встраивание в геном клетки-хозяина. Пребывание чужеродной ДНК в ядре клетки в свободном состоянии (в виде эписом) неизбежно ведет к ее элиминации даже в неделящихся клетках и, соответственно, к ее транзиторной (временной, обычно в течение нескольких месяцев) экспрессии. Необходимой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие соответствующих промоторов. В случае наличия тканеспецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного гена только в определенных тканях и клетках. Методы доставки чужеродных генов в клетки подразделяются на физические, химические и биологические.

Реальная интеграция чужеродной ДНК в геном клетки-реципиента может быть достигнута только с использованием ретровирусных и аденоассоциированных векторов.