 |
Клинико-генетические методы диагностики наследственных болезней. Скрининг-программы на наследственные заболевания
|
|
|
|
Современная генетика использует следующие специальные клинико-генетические методы диагностики: клинико-генеало- гический, цитогенетический, молекуляр- но-цитогенетический, биохимический, иммунологический, молекулярно-гене- тический, анализ сцепления генов.
Клинико-генеалогический метод с диагностической целью применяется практически всегда, а остальные - по показаниям, в зависимости от подозрения на ту или иную наследственную патологию. Клини- ко-генеалогическое обследование должно заканчиваться генетическим анализом. Наиболее частой ошибкой при использовании клинико-генеалогического метода является ограничение информации только опросом родственников. Этого, как правило, недостаточно. Для уточнения диагноза часто приходится проводить перекрестный опрос родственников, полное клиническое, лабораторное или инструментальное обследование членов семьи, а затем вновь возвращаться к генетическому анализу. Иногда только при подобном подходе удается выявить стертые формы наследственной патологии. С генетической точки зрения, обследование должно проводиться по принципу «меньше нельзя, а больше не нужно».
Среди лабораторных методов диагностики наследственных болезней особое место принадлежит клинико-биохимиче- ским методам.
Методы биохимической диагностики наследственных болезней направлены на описание биохимического фенотипа орга низма Выбор биохимических исследований может быть различным - от определения первичного биохимического продукта (по липептида) до исследования конечных про дуктов метаболизма (в крови моче поте и других биологических жидкостях) [2] Внедрение молекулярно-генетических ме тодов диагностики наследственных болез ней не означает что методы биохимической диагностики утратили свое значение Имен но благодаря молекулярно генетическим исследованиям удалось показать, что не всегда отсутствие выявленных мутаций ДНК при использовании молекулярно-гене тических методов равнозначно нормально му биохимическому фенотипу Поэтому в настоящее время в медико генетической практике биохимические методы сохраняют свое ведущее значение особенно для конт роля в процессе проводимого лечения Они являются взаимодополняющими методами лабораторного обследования больного
|
|
|
Лабораторная диагностика наследственных болезней проводится по опреде ленному плану и поэтапно, так квк провести лабораторное обследование конкретно го больного на все наследственные забо левания невозможно Стратегия лабора торной диагностики основана на данных клинического исследования больного (кли- ническии критерии) результатах клинико- генеалогического анализа (генетический критерий) и выборе лабораторных мето дов На основе поэтапного обследования постепенно исключаются или подтверждаются определенные классы болезней
В зависимости от класса выявляемых болезней лабораторная биохимическая ди агностика наследственных болезней часто носит дифференцированный характер Она может включать следующие пути и методы 1. Массовый скрининг (просеивающие программы) - выявление наследственных болезней (преимущественно наследствен ных дефектов метаболизма) путем массо вого обследования определенных детских контингентов, главным образом, новорожденных, независимо от состояния их здоровья Целью массового скрининга является выявление наследственных заболеваний в досимптоматической стадии, до развития клинической картины заболевания Методы массового скрининга экономически выгодны, однако на многие наследственные болезни не разработано простых и деше вых способов их выявления [3] Даже в раз витых странах (США, Канада, Япония и др) массовый скрининг проводится только на несколько заболеваний (ФКУ, болезнь мочи «с запахом кленового сиропа», врожденный гипотиреоз галактоземию, дефицит галактокиназы гомоцистинурию, де фицит биотинидазы и др) не более чем на 6-10 нозологических форм В России проводится массовый скрининг на два заболе вания - ФКУ и врожденный гипотиреоз Для исследования используют кровь, соб ранную на фильтровальную бумагу
|
|
|
Диагностика наследственного заболевания обмена веществ на доклинической ста дии позволяет рано начать лечение, предупредить развитие у ребенка тяжелых инва- лцдизирующих расстройств [4] Как правило, лечение заключается в исключении из раци она ребенка определенных продуктов, содержащих ингредиенты, могущие оказывать повреждающее действие на органы и систе мы организма Новорожденных с положительными результатами скрининга направ ляют в специализированные центры медико генетического профиля для подтверждения диагноза и назначения адекватного лечения 2. Селективный скрининг - предусма тривает обследование определенных дет ских коллективов с отклонениями в состоянии здоровья для выявления наследственной патологии Например, обследование всех детей с отклонениями в нервно- психическом развитии для диагностики на следственных дефектов обмена веществ Чаще всего для этих целей используются качественные или полуколичественные методы исследования мочи или крови
3. Верифицирующая (подтверждающая) биохимическая диагностика имеет целью подтвердить или отвергнуть диагноз у лиц с клиническими симптомами болезней или у лиц с подозрением на наследственные болезни, выявленные при массовом или селективном скрининге. С целью верификации наследственной патологии применяются соответствующие методы и лабораторная аппаратура.
Для диагностики могут использоваться различные биологические материалы (кровь, сыворотка крови, плазма, моча, пот, спинно-мозговая жидкость), культура клеток (фибробласты, лимфоциты, гепа- тоциты).
8.2.1. Биохимические материалы и методы биохимической диагностики наследственных болезней
А. Сыворотка (плазма) крови используется для следующих целей:
|
|
|
Определение содержания аминокислот методом жидкостной хроматографии высокого разрешения - помогает исключить нарушения обмена аминокислот, органических кислот, нарушения цикла мочевины, митохондриальные болезни.
Определение ацилкарнитина методом хроматографии с масс-спектрометри- ей используется для диагностики дефектов обмена жирных кислот и нарушений метаболизма органических кислот. Для исследования берутся кровь, взятая на фильтровальную бумагу, или плазма.
| Таблица 8 21 Изменения цвета мочи я предпелагаемая наследственная патология | |
| Окраска мочи | Предполагаемая болезнь |
| Черно-коричневая при стоянии или добавлении щелочи | Алкаптонурия |
| Красная | Порфирия, гемоглобинурия |
| Зеленая | Нарушение обмена билирубина (желтуха |
| с выделением бипивердина) | |
| Коричневая | Метгемоглобинурия, порфирия |
| Молочно-белая | Липидурия |
| Голубая | Наследственный дефект транспорта триптофана |
Исследование содержания лактата и пирувата в плазме используется в диагностике митохондриапьных болезней.
Определение уровня жирных кислот с очень длинной углеродной цепью, фитановой и пипеколовой кислот в сыворотке крови и плазмалогенов в эритроцитах с помощью методов хроматографии с масс-спект- рометрией или с помощью метода тандем- ной масс-спектрометрии позволяет верифицировать нарушения обмена пероксисом.
Методом электрофореза выявляются дефекты обмена гемоглобина (гемоглобинопатии).
Б. Анализы мочи. Для предварительной диагностики наследственных болезней имеет значение не только исследование тонких биохимических показателей, но и простая визуальная оценка цвета и запаха мочи может направить диагностический поиск в правильном направлении (табл. 8.2.1; 8.2.2).
Наряду с клинической характеристикой цвета и запаха мочи, большую роль в диагностике наследственной патологии играют результаты использования качественных и полуколичественных лабораторных селективных методов исследования крови и мочи, которые могут оказать неоценимую помощь в ранней диагностике наследственного заболевания (более подробные сведения о селективных методах представлены в главе 9).
|
|
|
Наряду с этим, используются биохимические аналитические тесты, которые часто служат для подтверждающей диагностики наследственных болезней и которые пока еще малодоступны для применения в широкой педиатрической практике. К ним относятся:
• определение экскреции органических кислот с мочой с помощью методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии
проводят при подозрении на наследственные нарушения в метаболизме аминокислот, органических кислот, наличии жирных кислот или митохондриальных болезней;
анализ на содержание оротовой кислоты (используется в диагностике нарушений цикла мочевины);
исследование ацилкарнитина и ацил- глицина при подозрении на дефицит карнитина, нарушение окисления жирных кислот, дефекты метаболизма органических кислот;
тонкослойная хроматография - чувствительный и специфический метод скрининга, направленный на выявление нарушений обмена гликозаминогликанов, оли- госахаридов и сиаловой кислоты и аминокислот;
желчные кислоты определяются методом хромато-масс-спектрометрии или тандемной масс-спектрометрии при нарушениях их обмена (пероксисомные болезни).
Могут применяться методы исследования тканевых культур (нативных и культивированных), направленные на определение активности ферментов (флюорометри- ческим методом).
Биохимические методы находят применение также для диагностики гетерозиготного носительства (болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность а-анти- трипсина, недостаточность глюкозо-6-фос- фатдегидрогеназы и др.).
Наряду с качественными лабораторными методами выявления наследственной патологии, в медико-генетической практике нашли широкое применение количественные методы и специальные методы подтверждающей диагностики наследственных болезней. К ним относятся методы цитогенетической (выявление хромосомных болезней), молекулярно-генетической, молекулярно- цитогенетической диагностики и исследование кариотипа тканевых культур (культура фибробластов и др.).
Разработки новых высоких технологий исследования ДНК и РНК, аналитической биохимии, иммунологии, энзимологии, на основе которых были разработаны новые или более совершенные методы диагностики наследственных болезней, расширили диагностические возможности клинической генетики и медико-генетической практики. Созданы целые программы диагностики наиболее распространенных моногенных наследственных заболеваний, разработаны показания для проведения исследований, необходимых для выявления отдельных классов наследственных дефектов обмена веществ - нарушения обмена аминокислот, органических кислот, обмена липидов и др.
|
|
|
Показаниями для исследования аминокислотного спектра крови и мочи являются:
положительные результаты селективного скрининга;
гипераммониемия;
подозрение на аминоацидемию;
подозрение на нарушение процессов клеточной биоэнергетики;
ренальные дисфункции - нефролити- аз, синдром Фанкони;
положительный нитропруссидный тест;
эпилептическая энцефалопатия;
| Таблица 822 Изменения запаха мочи и предполагаемая наследственная патология | ||
| Запах мочи | Определяющий химический фактор | Предполагаемая наследственная болезнь (при положительной реакции) |
| Мышиный «Кленового сиропа» «Прокисшего пива» Сернистый «Сырный» | Фенилуксусная кислота ot-кетокислоты с боковыми цепями (изокапроновая, изовалериановая) а-кетомасляная кислота Сероводород Изовалериановая кислота | Фенилкетонурия Болезнь мочи «с запахом кленового сиропа» Мальабсорция метионина Цистинурия, гомоцистинурия Изовалериановая ацидемия |
контроль за диетическим лечением специальными продуктами с ограничением или исключением белка.
Для перечисленных исследований используются количественные методы - ионообменная хроматография (плазма, моча, ликвор), качественные - тонкослойная хроматография (TLC), электрофорез на бумаге (моча).
Показания для исследования органических кислот в моче (органические кислоты определяются почти всегда только в моче, а не в других биологических жидкостях).
положительный селективный скрининг;
необъяснимые метаболические кризы (метаболический ацидоз, повышение лактата, пирувата, гипогликемия, кетонемия, неонатальная кетонурия, цитопения и др.),
клиническая картина систематической интоксикации;
подозрение на органическую ациду- рию, аминоацидемию;
подозрение на нарушение процессов клеточной биоэнергетики,
неясная гепатопатия;
неясные неврологические и нейромы- шечные расстройства;
эпилептическая энцефалопатия;
мультисистемное поражение органов и систем, особенно прогрессирование нарушений.
Методы:
газовая хроматография - масс-спект- рометрия (GC-MS);
тандемная масс-спектрометрия (Тап- dem-MS-MS).
Показания для исследования жирных кислот и кетоновых тел:
гипогликемия,
положительный тест на голодание
Методы:
флюорометрический;
газовая хроматография - масс-спектрометрия.
Показания для определения ацилкар- нитина:
подозрение на органическую ацидурию;
подозрение на дефект окисления жирных кислот;
гипогликемия.
Метод: тандемная масс-спектрометрия
Для определения пуринов и пирими- динов:
подозрение на нарушение метаболизма пуринов и пиримидинов;
необъяснимые неврологические нарушения;
нефролитиаз,
почечная недостаточность;
подагра;
анемия;
иммунодефицит
Методы:
высокоэффективная жидкостная хроматография;
газовая хроматография - масс-спектрометрия.
Для исследования метаболизма галактозы:
подозрение на нарушения обмена галактозы - у детей в 3-4-дневном возрасте после приема молока появление и прогрессирование рвоты, диареи, желтухи, нарушений печеночных функций, сепсиса).
Методы:
энзиматический;
радиохимический;
электрофорез;
изоэлектрофокусирование;
энзимодиагностика.
Исследования при подозрении на мукополисахаридозы и лизосомальные болезни накопления:
селективные тесты на ГАГ;
метод электрофореза;
энзимодиагностика (определение активности соответствующих ферментов в лейкоцитах или фибробластах)
Исследование метаболитов стерои- догенеза: при подозрении на нарушение обмена стероидов (синдром Смита-Лемли-Опитца и др.)
Методы: газовая хроматография с масс- спектрометрией.
Исследование желчных кислот: при подозрении на дефекты обмена желчных кислот и пероксисомные заболевания.
Метод: тандемная масс-спектрометрия (FAB-MS/GC-MS).
В последние годы в специализированных лабораториях используются и другие высокоточные методы биохимической диагностики. К ним относятся системы высокоэффективного капиллярного электрофореза с спектрофотометрическими, лазерными, флюорометрическими и масс-спект- ральными детекторами (позволяют анализировать белки, пептиды и нуклеиновые кислоты), гель-электрофорез белков и нуклеиновых кислот, блоттинг белков и нуклеиновых кислот, жидкостная хроматография с использованием хроматографов среднего и низкого давления, клиническая хроматография (ВЭЖХ) - с использованием хроматографов с различными видами детекции и диагностических тест-наборов и др
Разработаны программы диагностики наследственных болезней аминокислотного, жирового обменов, метаболизма углеводов и др Так, при диагностике гликоге- нозов используется двухэтапная система диагностики
На первом этапе - проводится определение глюкозы и лактата в крови с исследованием гликемических и лактатемиче- ских кривых после введения глюкозы, галактозы, адреналина, а также белка в виде творога На этом этапе можно судить об отсутствии или дефиците ферментов, участвующих в обмене гликогена При 1-м типе гликогеноза (дефицит глюкозо-6- фосфатазы) образующийся глюкозо-6- фосфат не расщепляется до глюкозы, а метаболизируется до лактата. Это вызывает гипогликемию и гиперлактате- мию При проведении нагрузочной пробы с глюкозой обнаруживается диабетопо- добная гликемическая кривая. После проведения нагрузочных проб с глюкозой исследуется гликемическая кривая в ответ на нагрузку адреналином Известно, что адреналин активирует систему фосфори- лаз и усиливает распад гликогена и выброс глюкозы в кровь. При гликогенозе I типа вследствие отсутствия глюкозо-6- фосфатазы отсутствует гипергликемиче- ский эффект.
В диагностике гликогенозов важное значение имеет проведение нагрузки галактозой, так как при всех формах гликогенозов из-за длительного и большого накопления гликогена в печени тормозится активность гликогенсинтетазы. Поэтому галактоза не превращается в печени в гликоген (как это происходит в норме), метаболизируется через ряд этапов в глюкозо-6-фосфат и затем в лактат с развитием гиперлактатемии. Нагрузка галактозой не проводится только при I типе гликогеноза, так как она способствует развитию тяжелого метаболического ацидоза из-за гиперлактатемии. Проведение адреналиновой нагрузки позволяет дифференцировать гликогеноз III и VI типов При III типе (дефицит амило-1,6-глюко- зидазы) в печени накапливается большое количество гликогена с укороченными цепями (лимит-декстрин), не расщепляемого фосфорилазой. Поэтому при введении адреналина отсутствует гипергликемический эффект При VI типе наблюдается не отсутствие, а дефицит фосфорилазы, поэтому адреналин активирует ее и концентрация глюкозы в крови повышается На первом этапе определяются также структура и концентрация гликогена в цельной крови и ее форменных элементах. На данном этапе выделяются гликогенозы из группы близких по клинической симптоматике заболеваний и предположительно устанавливается тип гликогеноза.
На 2-м этапе - проводится анализ био- птата печени. Берется печеночная ткань весом 25-50 мг и определяются концентрация и структура гликогена (в норме гликоген составляет 2-6% от веса ткани), активность ферментов глюкозо-6-фосфата- зы (в норме 4-13 мкмолей фосфора на 1 г ткани/мин), фосфорилазы (в норме - АМФ - 15-55 мкмолей фосфора на 1 г ткани/мин), фосфогексоизомеразы (в норме 4-13 мкмолей фруктозо-6-фосфата на 1 г ткани/мин), фосфоглюкомутазы (в норме 25-75 мкмолей фосфора на 1 г ткани/мин), амило-1,6-глюкозидазы (в норме 0,4-1,1 мкмолей глюкозы на 1 г ткани/мин), кислой альфа-глюкозидазы (в норме 0,6-2,4 мкмолей глюкозы на 1 г ткани/мин) Эти исследования позволяют поставить диагноз болезни и тип гликогеноза [5]
8.2.2. Методы диагностики хромосомных болезней
До недавнего времени диагностика хромосомных болезней базировалась на использовании традиционных методов цито- генетического анализа, включающего культивирование лимфоцитов периферической крови больного, фиксирование клеток на предметном стекле в соответствующей стадии митотического цикла (метафаза, профаза) с целью получения хромосомных препаратов и последующего анализа хромосом. Этот классический тип диагностики позволял судить о кариотипе - числе и структуре хромосом человека
Однако при таком подходе оставались недифференцированными некоторые сложные случаи хромосомной патологии, в их числе добавочная маркерная хромосома, сложные случаи хромосомного мозаи- цизма (в организме больного имеется несколько клонов клеток - нормальных и аномальных) Благодаря достижениям молекулярной генетики последних лет разработаны принципиально новые методы диагностики хромосомных болезней с помощью генно-инженерных методов, основанных на технологии получения рекомби- нантных молекул ДНК и использования их в виде ДНК-проб для диагностики наследственных дефектов [6-8]
Идентификация хромосомной патологии базируется на основе использования особого типа клонированных фрагментов ДНК человека - хромосомоспецифичных проб ДНК Используя эти пробы или зонды ДНК (тип клонированных фрагментов ДНК, которые характерны только для определенных пар хромосом), можно определить особенности хромосомного набора без прямого цитогенетического анализа с применением блот-гибридизации или гибридизации in situ
Метод гибридизации in situ модифицирован и разработан в отделе генетики Научного центра психического здоровья РАМН и лаборатории молекулярной цитогенетики Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ [9]
При этом используются хромосомо- специфичные ДНК-пробы практически на все хромосомы человека (точнее, на участки их околоцетромерного гетеро- хроматина)
Перечисленные пробы применяются с целью анализа происхождения добавочных маркерных или минихромосом (выявление генетического состава) определения сложного хромосомного мозаицизма, когда у больного имеется небольшой процент аномальных клеток, идентификации хромосом, вовлеченных в сложные хромосомные нарушения, уточнения точек разрыва аномальных хромосом
Эти методы с успехом используются в диагностике синдромов Клайнфельтера (кариотип полной формы 47,XXY), Шерешевского-Тернера (45,X), дисомии Y (47.XYY), трисомии X (47,XXX)
В использовании молекулярно-цитоге- нетической диагностики нуждаются до 30% случаев хромосомной патологии [6]
8.3. Молекулярно-генетические методы диагностики наследственных болезней. ДНК-диагностика
Современные молекулярно-генетические методы включают в себя большую группу методов, направленных на выявление вариаций в структуре ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки нуклеотидной последовательности ДНК [10-12] В основе этих методов лежат разработанные технологии исследования
ДНК и РНК. Современные методы молекулярной генетики позволяют изучать практически любой фрагмент ДНК человека. В тех ситуациях, когда известно, какое именно повреждение ДНК приводит к наследственному заболеванию, исследуется непосредственно фрагмент ДНК, содержащий повреждение - прямой метод ДНК-диагностики. Когда локализация повреждения неизвестна, используется другой подход, связанный с изучением окрестности гена, ответственного за генное заболевание в сочетании с семейным анализом, то есть используется косвенный метод [10, 13, 14]. ДНК-диагностика основана на методах, которые позволяют идентифицировать строго определенный фрагмент ДНК. Это достигается с помощью блот-гибридизации или амплификации.
Блот-гибридизация - высокочувствительный метод, позволяющий обнаружить последовательность ДНК в количестве нескольких пикограмм. При амплификации происходит многократное увеличение (в миллионы раз) количества анализируемого фрагмента ДНК, после которого возможен его анализ с помощью электрофореза и рестрикции. Амплификация фрагмента ДНК достигается за счет активности фермента ДНК-полимеразы, который в присутствии предшественников ДНК - дезоксинуклеотидтрифосфатов может синтезировать на однонитиевой матрице ДНК комплементарную нить. Для начала такого синтеза необходима «затравка» - небольшой фрагмент нуклеиновой кислоты, уже присоединившейся к однонитиевой ДНК. Такие затравки называются праймерами, и их можно синтезировать искусственно. Для амплификации используются два разных праймера, гибридизирую- щихся на противоположных концах комплементарных нитей данного фрагмента на некотором расстоянии друг от друга так, чтобы синтез происходил в направлении от одного праймера к другому.
Общие принципы этой диагностики включают:
1 -й этап. Забор крови из вены и выделение ДНК из клеток крови; накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью поли- меразной цепной реакции.
Для ДНК-диагностики наследственного заболевания не требуется исследовать всю выделенную ДНК, а достаточно изучения небольшого фрагмента генома. Однако для этого необходимо иметь большое количество копий таких фрагментов. Для получения этого количества проводится амплификация (умножение) фрагментов за счет полимеразной цепной реакции (ПЦР; PCR-реакция). Разработка методики данной реакции произвела революцию в молекулярной ДНК-диагностике наследственных болезней, так как позволила за короткое время (несколько часов) получить более 1 млн копий выделенного фрагмента ДНК. Единственным условием для проведения ПЦР является знание нуклео- тидной последовательности амплифициру- емого фрагмента.
й этап - рестрикция (разрезание) ДНК на фрагменты. Это осуществляется с помощью особых ферментов рестриктаз, которые разрезают ДНК в строго определенном месте. В результате образуется набор фрагментов ДНК различной длины.
й этап - электрофорез фрагментов ДНК на агарозном геле (или полиакрил- амидном геле). Поскольку фрагменты разной длины и молекулярного веса, их движение по гелю будет неодинаковым - более тяжелые будут двигаться медленнее, чем более легкие. Распределение фрагментов на геле будет в виде полос, форма и размеры которых сравниваются со стандартными образцами ДНК, размеры которых известны.
й этап. Поскольку полосы визуально не определяются, возникает необходимость их визуализации и идентификации. С этой целью после окончания электрофореза гель обрабатывается красителем (чаще этидия бромидом, но могут использоваться и другие), который связывается с ДНК. При ультрафиолетовом облучении поверхности геля он начинается светиться красным цветом. Разработаны методы автоматической регистрации этого процесса.
Визуализация представляет собой более сложный процесс идентификации конкретных фрагментов в геле среди всей геномной ДНК и выявления специфических фрагментов ДНК с помощью метода блот-гибридиза- ции по Саузерну. Для этого проводится денатурация ДНК с помощью щелочи, результатом является расщепление двухцепочеч- ной ДНК на две одноцепочечные молекулы. Далее ДНК переносится на так называемый «фильтр» (из нитроцеллюлозы или нейлона), который помещается на гелевую поверхность и под влиянием буферного раствора одноцепочечные фрагменты ДНК вымываются из геля и фиксируются на фильтре. Расположение фрагментов ДНК на фильтре точно соответствует их расположению на геле. Поскольку фиксированная ДНК не видна, проводится ее визуализация. Это достигается за счет гибридизации фрагментов со специфическим по нуклеотидной последовательности меченым радионуклидом или флюоресцентной меткой олигонуклео- тидным синтетическим зондом (зонд состоит из 16-30 пар оснований), который иногда называется клонированным фрагментом ДНК. Если нуклеотидная последовательность комплементарна изучаемому фрагменту на фильтре, то гибридизация осуществляется, а неспецифически связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры. Радиоактивно меченые участки выявляют путем помещения фильтра на рентгеновскую пленку, на которой после проявления видны полосы меченой зондом ДНК (авторадиография). Нерадиоактивные метки визуализируются с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител.
8.3.1. Методы ДНК-диагностики
Выделяют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики.
С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100%. Однако на практике указанные методы могут применяться только при определенных условиях'
при известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания;
должен быть клонированным ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность
Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аплелей Но к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация, и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. В связи с этим применяют косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней
Косвенные методы ДНК-диагностики основаны на анализе сцепления с исследуемым геном определенного полиморфного локуса (маркера), с помощью которого можно производить маркировку как мутантных, так и нормальных аллелей и анализировать их передачу в поколениях, то есть среди родственников обследуемого лица. Это особенно важно при решении вопроса о пренатальной (дородовой) диагностике наследственного заболевания.
Большие перестройки генома (делеции, инсерции, дупликации, транслокации) размером более 1 Мв, затрагивающие целые гены или несколько генов, могут определяться цитогенетическим анализом на про- метафазных хромосомах. Эффективность выявления этих нарушений может повышаться при исследовании клеток в интерфазах с использованием флюоресцентной гибридизации /л situ (FISH-метод).
Для выявления точковых мутаций и небольших делеций могут использоваться различные способы, однако все они основаны на применении метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей многократно умножить нуклеотидную последовательность ДНК, а затем осуществить поиск мутации Методы поиска фрагментов ДНК, несущих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных нук- леотидных последовательностей ДНК
Точковые мутации, локализованные в сайтах рестрикции, могут индентифици- роваться только при наличии ДНК-зондов ДНК-зонды - это клонированные последовательности геномной ДНК, изолированные из области локализации гена Они тесно сцеплены с геном или даже являются его фрагментом С помощью ДНК-зондов могут быть также выявлены и полиморфные локусы, которые, в свою очередь, могут использоваться как генетические маркеры определенных участков хромосом
В последние годы для прямой детекции моногенных болезней, мутации при которых обусловлены заменой одного или нескольких нуклеотидов, разработаны различные тонкие методы молекулярной диагностики (метод анализа конформационного полиморфизма однонитиевой ДНК - SSCP-ме- тод, метод анализа гетеродуплексов - НА метод, денатурирующий градиентный гель-электрофорез - DGGE-метод идр), которые используются в специализированных лабораториях
Заключительный этап молекулярно-ге- нетического анализа мутаций включает определение нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента ДНК (секвенирование), который сравнивается с нормой, и затем формулируется окончательный генетический диагноз
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть определена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК зондами (ПДРФ-анализ, или RFLP- анализ) Метод ПДРФ-анализа включает проведение нескольких этапов исследования выделение геномной ДНК, рестрикцию выделенной ДНК с помощью специфических эндонуклеаз, электрофоретическое разделение фрагментов ДНК, идентификацию фрагментов ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции с помощью блот- гибридизации по Саузерну При отсутствии рестрикции ДНК по данным радиоавтографии будет выявляться крупный (неразрезанный фрагмент, или бэнд) При наличии рестрикции выявляется меньший по размерам фрагмент У лиц гомозиготных по данному наследственному заболеванию определяется один бэнд, в то время как у лиц, гетерозиготных по данному наследственному моногенному дефекту, идентифицируются оба фрагмента ПДРФ-анализ значительно упрощается, если имеется возможность специфической амплификации участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции Проведение в этом случае ПЦР-реакции и рестрикции амплифициро- ванного фрагмента позволяет провести тестирование состояния этого локуса
Для косвенной диагностики могут использоваться так называемые «гипервариабельные сателлитные повторы» Они являются более информативными методами, чем ПДРФ-анализ, поскольку обладают высоким уровнем гетерозиготности и плотно расположены в каждой из хромосом В последние годы используются короткие тандемные повторы (STR-повторы, short tandem repeates), которые стабильно наследуются и обладают большим уровнем полиморфизма, а также короткие секвенированные последовательности ДНК с известной генной локализацией, так называемые «STS (sequence tagged sites)-noBTopbi» Последние обладают выраженной индивидуальной специфичностью, стабильно наследуются по законам Менделя и находят широкое применение для молекулярно-генетической диагностики моногенных болезней Они могут также использоваться в качестве молекулярных маркеров мутантных хромосом в семьях высокого риска Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в прена- тальной диагностике практически для всех моногенных заболеваний. Однако для этого необходимо иметь информацию о том, что локус является высокополиморфным и находится вблизи от мутантного гена или внутри него. Поэтому для диагностики требуется обследование как можно большего числа родственников (в первую очередь, родители-дети), чтобы проследить путь передачи маркеров потомству. Это повышает информативность выбранного маркера.
При использовании косвенных методов ДНК-диагностики следует помнить, что чем теснее сцепление между маркерным локусом и мутантным геном, тем точнее диагноз. Чтобы свести до минимума ошибку диагностики, необходимо, по возможности, использовать внутригенные маркеры или два маркерных локуса, фланкирующих мутантный аллель.
С середины 80-х годов спектр методов диагностики дополнился новым направлением - так называемой «преимплантацион- ной» диагностикой врожденных аномалий [15]. Клиническая генетика использовала давно применяемый в экспериментальной эмбриологии метод выращивания зародышей в лабораторных условиях с последующей пересадкой в слизистую матки. У вырв- щенного зародыша производится диагностика наследственных болезней на пре- имплантационной стадии - до 5-7-го дня после оплодотворения. Условием ее использования является наличие микрометодов диагностики заболевания (на уровне одной и/или нескольких клеток) и владение техникой микробиопсии для получения небольшого числа клеток без повреждения зародыша. Преимплантационный зародыш получают методом маточного лаважа (в период 90-130 ч после оплодотворения, когда зародыш спускается из маточной трубы в матку) или путем оплодотворения в пробирке. Метод «улавливания» зародыша является безопасным и безболезненным; он не оказывает отрицательного воздействия на последующие беременности и овариальные циклы.
Успешная беременность после подсадки зародыша в матку наступает примерно в 50% случаев.
С помощью этого метода у женщин, гетерозиготных по гену отдельных наследственных заболеваний, отбирают для оплодотворения те яйцеклетки, которые не несут мутантного гена. Отбор осуществляется путем генетического анализа с использованием современной технологии поли- меразной цепной реакции. При обнаружении мутантного гена оплодотворение не производится. Появились сообщения о преимплантационной диагностике пола плода, муковисцидоза, выявления у женщин-носительниц гена дефицита альфа- антитрипсина (с использованием метода полимеразной цепной реакции).
Обсуждаются возможности преимплантационной генетической диагностики при проведении программы ЭКО (экстракорпорального оплодотворения) в случаях повышенного риска появления потомства с генетической или хромосомной патологией.
8.4. Компьютерные справочно-диагностические системы и базы данных по наследственным болезням
К настоящему времени представлено более 15 ООО описаний моногенных болезней, синдромов и признаков. Неуклонный рост числа «новых» наследственных болезней, выраженный клинический полиморфизм и генетическая гетерогенность многих из них создают многочисленные трудности в процессе диагностики наследственных заболеваний [16]. Многие из наследственных форм патологии (наследственные синдромы) встречаются относительно редко, что создает дополнительные диагностические затруднения, особенно в случаях их описания по именам исследователей. Все это затрудняет практическую работу врача. Вместе с тем точная диагностика наследственной болезни или синдрома имеет далеко не академическое значение. Ошибочный диагноз - это ошибки медико-генетического консультирования, неправильная ориентаци
|
|
|
