 |
Флуоресценция (люминесценция)
|
|
|
|
Флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса).
При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.
Устройство флуоресцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от обычного светового микроскопа в основном следующим:
1. Наличие мощного источника света в осветителе, излучающего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа или галогенная кварцевая лампа).
2. Наличие системы светофильтров:
- возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию;
- теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику флуоресцентного микроскопа;
- "запирающие" светофильтры расположены между окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.
Способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции заключается в том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объектов, имеющих большую числовую апертуру, т. е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов.
|
|
|
Поскольку большинство микроорганизмов не обладают собственной люминесценцией существует несколько способов их обработки для наблюдения в флуоресцентном микроскопе. Прежде всего, это флуорохромирование - окрашивание сильно разведенными (до нескольких микрограмм/мл) растворами флуоресцирующих красителей (флуорохромов). Флуоресцентная микроскопия по сравнению с обычной позволяет:
•сочетатьцветное изображение и контрастность объектов;
• изучать морфологию живых и мертвых клеток микроорганизмов в питательных средах и тканях животных и растений;
• исследовать клеточные микроструктуры, избирательно поглощающие различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическимииндикаторами;
•определятьфункционально-морфологическиеизмененияклеток;
• использовать флуорохромы при иммунологических реакциях и подсчете бактерий в образцах с невысоким их содержанием.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) является методом оптического 3-мерного (3D) поверхностного профилирования с высокой разрешающей способностью.
Высокая числовая апертура линзового объектива (до 0,95) и короткая длина волны лазерного излучения обеспечивают изображение с высоким разрешением вдоль оптического и поперечного направлений. Конфокальное отверстие также улучшает качество изображения, оставляя шум вне фокуса. Получение изображения в режиме реального времени достигается за счет модуля быстрого сканирования и алгоритма обработки сигналов. Для получения 3D профиля поверхности образца требуется менее 1 секунды. Конфокальная микроскопия (CLSM) является техникой оптического неразрушающего профилирования высокого разрешения 3D поверхностей микроструктур. Это является идеальным решением для измерения и проверки полупроводниковых пластин, FPD продуктов, MEMS устройств, поверхностей стекла и других материалов.
|
|
|
Способность измерения высоты достигается благодаря конфокальному расположению источника, образца и детектора. Когда образец находится в фокальной плоскости объектива, свет, отраженный на поверхности образца, ориентирован на конфокальное отверстие, а фотодетектор собирает сигнал от образца. Однако образец помещают в положение не в фокусе, световой сигнал отклоняется конфокальной диафрагмой. Таким образом только сигнал в фокусе попадает на фотодетектор. Этим объясняется оптическая селективная способность CLSM техники.
Для получения 3D профиля поверхности образца, оптические изображения собираются вдоль оси Z. Благодаря конфокальному отверстию интенсивность света максимальна, когда образец располагается в фокальной плоскости.
13. Рентгеновская микроскопия
Рентгеновская микроскопия — совокупность методов исследования микроскопического строения вещества с помощью рентгеновского излучения. В рентгеновской микроскопии используют специальные приборы — рентгеновские микроскопы. Разрешающая способность достигает 100 нм, что в 2 раза выше, чем у оптических микроскопов (200нм). Теоретически рентгеновская микроскопия позволяет достичь на 2 порядка лучшего разрешения, чем оптическая (поскольку длина волны рентгеновского излучения меньше на 2 порядка). Однако современный оптический микроскоп - наноскоп имеет разрешение до 3-10нм.
Рентгеновская микроскопия разделяется на:
· Отражательная микроскопия
· Проекционная микроскопия
· Электронная микроскопия
· Рентгеновская лазерная микроскопия
Отражательные
В микроскопах этого типа используются приёмы, позволяющие добиться максимального увеличения, благодаря чему линейное разрешение проекционных рентгеновских микроскопов достигает 0,1—0,5 мкм. В качестве линз в них используется система зеркал. Изображения, создаваемые отражательными рентгеновскими микроскопами даже при точном выполнении профиля их зеркал искажаются различными аберрациями оптических систем: астигматизм, кома.
Отражательные рентгеновские микроскопы не получили широкого распространения из-за технических сложностей их изготовления и эксплуатации.
|
|
|
Проекционные рентгеновские микроскопы представляют собой камеру, в противоположных концах которой располагаются источник излучения и регистрирующее устройство. Для получения чёткого изображения необходимо, чтобы угловая апертура источника была как можно меньше.
Увеличение (М) в методе рентгеновской проекционной микроскопии определяется отношением расстояний от источника рентгеновского излучения до детектора (b) к расстоянию от источника до объекта (а):
М = b/a
В микроскопах такого типа до недавнего времени не использовались дополнительные оптические приборы. Основным способом получить максимальное увеличение является размещение объекта на минимально возможном расстоянии от источника рентгеновского излучения. Для этого фокус трубки располагается непосредственно на окне рентгеновской трубки либо на вершине иглы анода, помещенной вблизи окна трубки. В последнее время ведутся разработки микроскопов, использующих зонные пластинки Френеля для фокусировки изображения. Такие микроскопы имеют разрешающую способность до 30 нанометров.
Для фокусировки рентгеновского излучения применяются также изогнутые монокристаллы. Но при этом на качество изображения сказываются структурные несовершенства монокристаллов, а также конечная величина брэгговских углов дифракций.
Ла?зерная рентге?новская микроскопи?я — разновидность рентгеноструктурного анализа, основанного на дифракции рентгеновских лучей на исследуемом объекте. В отличие от традиционного рентгеноструктурного анализа, исследуется одиночные молекулы и их сочетания.
Для получения и дальнейшей регистрации дифракционной картины на одиночном объекте требуется:
высокая концентрация энергии излучения на исследуемом объекте как из-за его размера (традиционный рентгеноструктурный анализ имеет дело с кристаллами из исследуемых объектов), так и из-за ограниченной чувствительности принимающей аппаратуры (при недостаточной энергии не удастся зафиксировать картину);
|
|
|
малое время экспонирования, так как вследствие высокой концентрации энергии объект неизбежно разрушается излучением. Характерные временные интервалы — несколько фемтосекунд (10?12 с);
высокая пространственная когерентность излучения (длина когерентности должна быть по крайней мере сравнима с длиной оптического пути прибора), в противном случае из-за малого времени экспонирования возникающее искажение фазы не позволит сформировать устойчивую дифракционную картину.
Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны. Это позволяет наглядно демонстрировать и изучать, в том числе количественно, распределение веществ в живых клетках или фиксированных препаратах. Так, например, белки и нуклеиновые кислоты одинаково прозрачны для видимого света; рассматривая неокрашенную клетку в видимом свете, нельзя определить, где расположен белок или нуклеиновая кислота. Но ультрафиолетовые лучи определенной длины нуклеиновая кислота поглощает значительно сильнее, чем белок. Поэтому в ультрафиолетовом микроскопе участок, содержащий нуклеиновую кислоту, выглядит значительно темнее. Так как ультрафиолетовые лучи непосредственно глазом не воспринимаются, приходится применять специальные преобразователи света. Ультрафиолетовая микроскопия технически значительно сложнее обычной световой, ее аппаратура дороже и методика тоньше. Несмотря на это, применение ее оправдано, так как научная значимость быстрого топографического описания химического состава живой клетки весьма велика.
Гораздо более доступна и перспективна люминесцентная микроскопия (см.), широко применяемая ныне в научно-исследовательских и клинико-диагностических лабораториях. При этом живой объект обрабатывают специальными красителями, которые, будучи освещены синим, фиолетовым или ультрафиолетовым светом, начинают светиться, излучая более длинные волны (зеленые, желтые). Цвет возбужденного вторичного свечения зависит от химических свойств объекта и введенного в него красителя.
14. Электро́нная микроскопи́я — совокупность методов исследования с помощью электронных микроскопов микроструктур тел, их локального состава и локализованных на поверхностях или в микрообъемах тел электрических и магнитных полей.
Просвечивающая электронная микроскопия
В просвечивающем электронном микроскопе используется высокоэнергетический электронный пучок для формирования изображения. Электронный пучок создается посредством катода (вольфрамового, LaB6, Шоттки или холодной полевой эмиссии). Полученный электронный пучок ускоряется обычно до 80—200 кэВ (используются различные напряжения от 20 кВ до 1 МВ), фокусируется системой магнитных линз (иногда электростатических линз), проходит через образец так, что часть электронов рассеивается на образце, а часть — нет. Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фотопластинке или ПЗС-камере.
|
|
|
Разрешение ПЭМ лимитируется в основном сферической аберрацией. Некоторые современные ПЭМ имеют корректоры сферической аберрации.
Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100 нм) и неустойчивость(разложение) образцов под пучком.
Просвечивающая растровая(сканирующая) электронная микроскопия (ПРЭМ )
Один из типов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), однако есть приборы работающие исключительно в режиме ПРЭМ. Пучок электронов пропускается через относительно тонкий образец, но, в отличие от обычной просвечивающей электронной микроскопии, электронный пучок фокусируется в точку, которая перемещается по образцу по растру.
Растровая (сканирующая) электронная микроскопия
В основе лежит телевизионный принцип развертки тонкого пучка электронов по поверхности образца.
Трансмиссионная электронная микроскопия. Трансмиссионный электронный микроскоп — это система визуализации изображения, которая теоретически обеспечивает очень высокое разрешение (0,1 нм). На практике, однако, разрешение, получаемое большинством хороших приборов, составляет около 3 нм. Такое высокое разрешение делает возможным изучение деталей при увеличении вплоть до 400 000 раз. К сожалению, этот уровень увеличения применим только к изолированным молекулам или частицам. Очень тонкие тканевые срезы можно детально изучать при увеличениях примерно до 120 000 раз. В основе действия трансмиссионного электронного микроскопа лежит принцип, согласно которому электромагнитные поля способны отклонять пучок электронов таким же образом, что и стеклянные линзы, отклоняющие свет. В электронном микроскопе электроны испускаются в результате нагревания в вакууме очень тонкой металлической (обычно вольфрамовой) нити (катода). Испускаемые электроны далее попадают в условия разницы потенциалов порядка 60—120 кВ между катодом и анодом, представляющим собой металлическую пластинку с отверстием в центре. Электроны, таким образом, привлекаются к аноду и разгоняются до высоких скоростей. Они проходят через центральное отверстие в аноде, формируя постоянный поток (или пучок) электронов, который проникает в колонну микроскопа.
Устройство электронного микроскопа очень сходно с конструкцией оптического микроскопа, хотя оптика электронного микроскопа обычно располагается в обратном порядке. Первая линза — это конденсор, который фокусирует пучок электронов на срезе. Некоторые электроны взаимодействуют с атомами в срезе и продолжают свой ход, тогда как другие просто проходят сквозь образец без взаимодействия.
Чтобы создать хорошее взаимодействие между образцом и электронами, в электронной микроскопии используют очень тонкие срезы (40—90 нм), поэтому заливку производят в смолу, которая очень сильно затвердевает. Полученные блоки настолько твердые, что для изготовления срезов требуются стеклянные или алмазные ножи. Чрезвычайно тонкие срезы помещают на маленькие металлические сетки и помещают внутрь микроскопа для изучения. Метод замораживания позволяет исследовать ткани с помощью электронной микроскопии, при этом необходимость в фиксации и заливке отсутствует. Метод дает меньше артефактов, чем стандартная подготовка тканей, хотя он обычно отличается трудоемкостью.
|
|
|
