Разрушение клеточной и ядерной мембран.

Внутри клеток геномная ДНК целиком сосредоточена в ядре, клеточная и ядерная
мембраны полностью деградируют после обработки суспензии
клеток детергентом. Именно по этой причине детергент или композиция из нескольких детергентов—обязательный компонент любого раствора для экстракции ДНК.

Отделение ДНК от белков. ДНК представлена в клетке комплексом с белками, связанными с нуклеиновой кислотой как слабыми водородными, так и сильными электростатическими и ковалентными связями. Кроме того, белки как высокомолекулярные
природные полимеры при выделении ДНК часто механически
«сплетаются» с ней. Некоторые белки-ферменты могут расщеплять ДНК, и при их совместной с ДНКэкстракции может произойти химическая (ферментативная) деградациянуклеиновой кислоты. Поэтому получить препарат геномной ДНК совершенно без примеси белков и повреждений практически не удается, тем
более что большинство способов очистки от белка основаны на их
денатурации фенолом, что может нарушить целостность первичной структуры самой нуклеиновойкислоты. Для обезжиривания препаратов и освобождения их от фенола используютхлороформ.
Очистка ДНК от примесей низкомолекулярных веществ. Выделить ДНК из животных тканей значительно проще, чем из растительных, так как ее удельное содержание в животных клетках (0,25 % массы клетки, например, у млекопитающих) в среднем
выше, чем в растительных (0,01—0,1 %). Кроме того, в вакуолях
растительных клеток могут накапливаться химически активные
вещества, способные взаимодействовать во внеклеточной среде с
образованием разнообразных продуктов (отличных от уже упоминавшихся смол). Такие вещества, как гликоалкалоиды, танины, фенолы, ряд катионов тяжелых металлов способны ингибировать широко распространенные в практике молекулярной биологии,но весьма «прихотливые» к составу реакционной среды ферменты
(рестриктазы, лигазы, ДНК-полимеразы). В таком случае использование экстрагированной ДНК становится невозможным. Поэтому очистка ДНК от низкомолекулярных соединений,которую производят путем переосаждения (перекристаллизации) нуклеиновой кислоты спиртом, является обязательным этапом или несколькими этапами) выделения ДНК из растительных тканей.

Методы выделения ДНК условно делят на аналитические и препаративные, что зависит от количества требуемой ДНК. Эти методы различаются величиной навесок исходногоматериала,объемами растворов реагентов. В данном руководстве экстракцию
ДНК из растительных тканей предлагается проводить препаративным методом (хотя представленную методику можно успешно применять и в аналитических целях), а из животных — препаративно-аналитическим. Главное условие — строгое соблюдение исходно установленных соотношений навесок и объемов реагентов.

Препарат выделенной ДНК (учитывая вероятное присутствие з
нем ферментов, способных разрушать нуклеиновые кислоты, а также особенности молекулярной структур ДНК) рекомендуется хранить в замороженном состоянии. Причем замораживание препарата следует проводить при температуре —56 "С и ниже, чтобы он не сопровождался кристаллизацией и льдообразованием, что
может стать причиной разрывов нитевидных молекул ДНК. Для
таких целей можно использовать специальные низкотемпературные морозильные камеры — криогенераторы, криостаты или кельвинаторы. Препарат ДНК можно хранить и в бытовой морозильной камере (-18 °С) при условии, что размораживание будет проводиться нечасто. Другой способ — хранение ДНК в виде
осадка в неводной среде, чаще всего под 70%-ным этанолом.
Спиртовой осадок ДНК компактен и практически не подвержен
механическому и ферментативному разрушениям, так как подавляющее большинство ферментов неактивно в спиртовом растворе.

Занятие № 1
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ЖИВОТНЫХ ОРГАНИЗМОВ С ДДС-Na

Цель занятия. Освоить один из «классических» методов выделения и очистки ДНК из животных объектов с помощью ДДС-Ш.

Оборудование и материалы. 1. Термостат («водяная баня»), 2. Центрифуга до
10 000 # для пробирок вместимостью 10—15 мл. 3. Фарфоровые ступки с пестиками. 4. Весы лабораторные на 0,01—10 г.5.Пробирки центрифужные вместимостью до 15 мл с завинчивающейся крышкой. 6. Образец животных тканей массой100мг.7.Жидкий азот в сосуде Дьюара. 8. 1 М трис-НС\ буферный раствор,
рН 8*. 9. 5 М раствор ЫаС1*. 10. 0,5 М раствор ЭДТА-Ма, рН 8. 11. 10%-ный раствор ДДС-№. 12. ТЕ-буфер (10 мМ трис-ЯС\,1мМЭДТА-№рН8*).13.Деионизованная вода. 14. Смесь хлороформ + изоамиловый спирт (24: 1), насыщенная
ТЕ-буферомрН8**.15.Фенолперегнанный,насыщенныйТЕ-буферомрН8**.16. Раствор протеиназы К (20 мг/мл, готовить на стерильной деионизованной воде)***. 17. Раствор рибонуклеазы (РНКазы) А (10 мг/мл, готовить на стерильной деионизованной воде, после растворения препарата раствор выдержать 15 мин на
кипящей водяной бане для инактивации ДНКаз)*. 18. Изопропанол. 19. 10 М раст-
вор ацетата аммония. 20. 96%-ный этанол. 21. 70%-ный этанол.

* Хранить при температуре 2—8 °С.

** Хранить в темноте при температуре 2—8 °С.

*** Хранить при температуре —18 °С.

Ходработы. Приготовление экстрагирующего буф ера.

Внимание! Использовать только свежеприготовленный раствор.

1. Смешивают отдельные компоненты экстрагирующего буфера БВ (от англ. сН§е81юп ЬиЯег) в соответствии с требуемым объемом конечного раствора, исходя из указанных пропорций

(ТабЛ.2).