 |
Определение активности протеаз (по методу Ансона)
|
|
|
|
Метод определения активности протеаз основан на определении тирозина (или тирозинсодержащих пептидов), освобождающихся при гидролизе раствора стандартного белка (гемоглобина, казеина, альбумина) протеазами (пептидгидролазами). Оставшийся нерасщепленный белок осаждают раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и фильтруют. С фильтратом проводят цветную реакцию с реактивом Фолина и оптическую плотность полученного раствора измеряют при 280 нм на ФЭКе.
ХОД РАБОТЫ. Берут две пробирки. В каждую наливают по 1 мл раствора гемоглобина и по 1,5 мл фосфатно-цитратного буфера рН 2,2. Содержимое перемешивают и пробирки ставят в термостат при 37-38 °С на 5 мин. Одновременно выдерживают в термостате раствор пепсина. После термостатирования в одну пробирку (контрольная) добавляют 5 мл раствора с массовой долей ТХУ 5 % и перемешивают. Затем в обе пробирки приливают по 0,5 мл раствора ацидин-пепсина (или пепсина), предварительно выдержанного в термостате при 37-38 °С, содержимое перемешивают и пробирки помещают в термостат при 37-38 ºС на 30 мин. После инкубации в другую пробирку (опытная) добавляют 5 мл раствора с массовой долей ТХУ 5 % и оставляют ее в термостате на 10-15 мин для осаждения не прореагировавшего белка и фермента. Содержимое опытной и контрольной пробирок фильтруют и в прозрачном фильтрате определяют продукты ферментативного гидролиза – тирозин (или тирозинсодержащие пептиды). ТХУ продукты распада белка не осаждает.
Берут две чистые пробирки и вносят в них соответственно из опытной и контрольной проб по 2 мл фильтрата. Затем в каждую медленно приливают по 5 мл раствора с концентрацией карбоната (или гидроксида) натрия 0,5 моль/л и по 1 мл рабочего (разбавленного 1:2) раствора Фолина. Содержимое перемешивают и пробирки оставляют при комнатной температуре на 20 мин. После этого интенсивность окраски опытной и контрольной проб определяют на ФЭКе с красным светофильтром. Массу тирозина в пробе находят по калибровочному графику.
|
|
|
Протеолитическую активность выражают в мг (или мкмоль) тирозина, освободившегося на 1 мг белка ферментного препарата (или 1 мл ферментного раствора) за 1 мин. При подсчете необходимо помнить, что продолжительность инкубации составила 30 мин.
Принцип определения, порядок работы, результат анализа записывают и делают вывод об активности ферментного препарата.
РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; фосфатно-цитратный буфер рН 2,2 (196 мл раствора с концентрацией лимонной кислоты 0,1 моль/л смешивают с 4 мл раствора с концентрацией гидрофосфата натрия 0,2 моль/л); растворы с массовыми долями: гемоглобина 1 % (приготовлен на фосфатно-цитратном буфере рН 2,2), ТХУ 5 %, ацидина-пепсина 1 % (4 таблетки препарата растворяют в 100 мл воды) или пепсина 0,1 % в растворе с массовой долей соляной кислоты 0,2 % (4,5 мл концентрированной соляной кислоты разбавить в мерной колбе до 1 л); раствор с концентрацией карбоната натрия (или гидроксида натрия) 0,5 моль/л; раствор тирозина для построения калибровочного графика, содержащий в 1 мл 500 мкмоль (4,53 мг тирозина растворяют в 50 мл раствора с массовой долей соляной кислоты 0,2 %); реактив Фолина, разбавленный в соотношении 1:2. Реактив Фолина готовится следующим образом: 100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия растворяют в 700 мл дистиллированной воды. К раствору прибавляют 50 мл 85% ортофосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь кипятят с обратным холодильником 10 часов, после чего прибавляют 150 г сернокислого лития, 50 мл дистиллированной воды и несколько капель бромной воды. Для удаления избытка брома смесь кипятят без холодильника 15 мин в вытяжном шкафу. После охлаждения раствор доводят дистиллированной водой до 1 литра, фильтруют и хранят в темной склянке. Цвет реактива должен быть желтым. Перед употреблением его разбавляют водой 1:2 (готовят рабочий раствор).
|
|
|
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.
1. К какому классу и подклассу ферментов относятся протеазы?
2. Специфичность действия протеаз.
3. Промежуточные и конечные продукты гидролиза белков под действием протеаз.
4. Где протекает гидролиз белков в живых организмах и роль этих процессов.
5. Принцип метода Ансона определения активности протеаз.
6. Последовательность определения активности протеаз по Ансону.
7. Расчет протеолитической активности ферментов по Ансону.
Глава 6. Липиды и их обмен
Липидами называют большую и разнообразную группу веществ тканей животных и растений, которые могут быть экстрагированы из них неполярными растворителями: эфиром, бензолом, хлороформом, петролейным эфиром и др.
Липиды можно разделить на две большие группы: нейтральные жиры (ацилглицеролы) и жироподобные вещества, называемые липоидами. К липоидам относят воски, фосфолипиды (фосфатиты), гликолипиды, стероиды, растворимые в жирах пигменты (каротиноиды, хлорофилл) и жирорастворимые витамины.
В организме животных и растений липиды находятся в форме запасного жира и входят в состав структурных компонентов клеток. Запасной жир откладывается в определенных частях организма животных и растений, используется в качестве энергетического материала, содержание его зависит от многих факторов. Липиды структурных компонентов клеток (цитоплазматические липиды) выполняют различные биологические функции и содержание их в клетках постоянно.
Массовая доля липидов в организме человека не превышает обычно 10-20 %, в организме животных она может достигать 50 %. Массовая доля липидов в пересчете на сухую массу семян пшеницы, ржи, ячменя составляет 2-3 %; овса, кукурузы, проса – 4-6 %; льна, конопли, подсолнечника – 30-50 %; хлопчатника, сои – 20-30 %; мака, клещевины – 50-60 %; картофеля, свеклы, овощей – 0,1-1 % от сырой массы.
Липиды молока носят общее техническое название: молочный жир. В его состав входят: нейтральные жиры (три-, ди- и моноацилглицерины, свободные жирные кислоты), фосфолипиды (главным образом фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины), стерины (в основном холестерин) и гликолипиды. Составные части молочного жира содержатся в жировых шариках, оболочке жировых шариков и в виде следов – в молочной сыворотке. Массовая доля молочного жира в молоке колеблется в пределах 2,8-5 %. От общей массы молочного жира на долю триацилглицеринов приходится 98-99 %.
|
|
|
Нейтральные жиры (жиры, триацилглицерины, ацилглицеролы) – это сложные эфиры трехатомного спирта глицерола (1,2,3-пропантриола) и жирных кислот. В зависимости от числа этерифицированных гидроксильных групп глицерола (три, две или одна) различают соответственно триацилглицеролы, диацилглицеролы и моноацилглицеролы. Триацилглицеролы составляют основную массу природных жиров. Поэтому
O
ïç
СН2 -О-С-R1
O
ïç
CH-O-C-R2
O
ïç
CH2 -O-C-R3
Триацилглицерол
термин триацилглицерол часто используют как синоним термина жир или нейтральный жир. Моноацилглицеролы и диацилглицеролы хотя и представляют собой важные промежуточные продукты липидного обмена, но в составе природных жиров встречаются в малых количествах.
В формуле R1, R2, R3 - остатки жирных кислот. Номенклатура нейтральных жиров основывается на названиях жирных кислот, входящих в состав их молекул. Например: тристеарин, трипальмитин, олеодипальмитин, олеостеаропальмитин и т.д.
В составе природных ацилглицеролов найдено несколько десятков различных жирных кислот. Все они отличаются друг от друга длиной углеводородной цепи, степенью ненасыщенности, числом и положением двойных связей и т.д.
В составе жиров содержание ненасыщенных жирных кислот выше, чем насыщенных. Особенно это заметно в жирах организмов, живущих при низких температурах. Это связано стем, что ненасыщенные жирные кислоты имеют более низкую температуру плавления и содержащие их нейтральные жиры остаются жидкими даже при температуре ниже 5 °С. Ненасыщенные жирные кислоты преобладают в растительных жирах, называемых маслами.
|
|
|
Присутствие в жирах большого количества ненасыщенных жирных кислот придает им жидкую консистенцию, содержание преимущественно насыщенных жирных кислот – твердую консистенцию при комнатной температуре.
О природе и качестве жира можно судить по его физическим и химическим величинам, называемым константами. Среди физических констант жира наибольшее значение имеют: плотность, вязкость, температура плавления и отвердевания; среди химических (называемых «числами» жира) - йодное число, кислотное число, число омыления и эфирное число.
Перед определением констант жир разогревают в термостате при 55-60 °С, в этом же термостате его фильтруют через сухой бумажный фильтр. Затем охлаждают до комнатной температуры и используют для исследования.
|
|
|
