 |
Дезоксирибонуклеиновые кислоты
|
|
|
|
Первичная структура ДНК.
ДНК, подобно белкам, имеет первичную, вторичную и третичную структуры. Последовательность чередования нуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК составляет ее первичную структуру. Определение первичной структуры ДНК оказалось крайне сложной и трудной задачей, так как размеры молекулы огромны, а нуклеотиды бывают всего четырех видов. Больших успехов в изучении структуры ДНК достигли Э. Чаргафф и сотрудники его лаборатории, которые, используя метод хроматографии, впервые (1950) определили нуклеотидный состав ДНК, выделенной из разных объектов. Они установили, что соотношение в ДНК азотистых оснований подчиняется универсальным закономерностям, которые получили название правила Чаргаффа.
Эти исследования на огромном экспериментальном материале показали, что внутри ряда систематических групп нуклеотидный состав ДНК специфичен для каждого вида. Установлено, что у большинства животных преобладает АТ-тип строения ДНК. У бактерий наблюдается разброс нуклеотидного состава от сильно выраженного ГЦ-типа до АТ-типа. Нуклеотидный состав ДНК бактерий используют в настоящее время как один из систематических признаков в исследованиях по таксономии. Этот признак позволяет уточнять родство отдельных бактериальных видов, решать спорные вопросы классификации. Однако даже при одинаковом количественном соотношении А, Т, Г, Ц строение ДНК может быть различным, поскольку оно обусловлено также последовательностью расположения нуклеотидов.
Вторичная структура ДНК. В 1953 г. Д. Уотсон и Ф. Крик установили, что ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух антипараллельньгх полинуклеотидных цепей. Это заключение явилось результатом большого числа экспериментальных данных и первичных обобщений. К ним относятся работы. Э. Чаргаффа и его сотрудников, которые показали, что нуклеотидный состав ДНК жестко сбалансирован. Они свидетельствуют о том, что полинуклеотидная цепь ДНК расположена в форме спирали с периодом идентичности (шагом) 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм. Физико-химическими исследованиями было установлено, что в молекуле ДНК между амино- и кетогруппами азотистых оснований образуются водородные связи.
|
|
|
Рис. 6. Спаривание аденина с тимином и гуанина с цитозином в молекуле ДНК.
водородные связи показаны пунктиром
Расстояния между гликозидными связями одинаковы для каждой пары нуклеотидов— 1,085 нм. Цепи ДНК направлены противоположно друг другу, т. е. антипараллелъны. Стабильность двойной спирали определяется в основном взаимодействием расположенных друг над другом, как стопка монет, азотистых оснований. Расстояние между плоскостями оснований (0,34 нм) примерно эквивалентно сумме ван-дер-ваальсовых радиусов ароматических колец. При этом создаются условия для возникновения особого рода ван-дер-ваальсовых сил — стэкинг-взаимодействий.
4.3. Физико-химические свойства ДНК. Хромосомы животных, бактерий, вирусов содержат по одной непрерывной ДНК-спирали огромной длины по сравнению с размерами ядра (табл. 7).
Таблица 7. Размер различных молекул ДНК (по В. А. Ратнеру)
| Объект | Длина хеликса, мкм | Размер, кб1 | Форма |
| Онкогенный вирус SV40 Фаг ΨХ174 Фаг λ Хромосома E.coli Хромосомы дрожжей Х-Хромосома дрозофилы Средняя хромосома мыши | 1,7 1,8 17,0 50—750 1042 3,4×104 | 5,2 5,5 48,0 (2—3) ×103 1,5х102— 2,2×103 З×104 11,З×104 | Двухцепочечная кольцевая Одноцепочечная Двухцепочечная линейная |
Молекулярная масса ДНК определена с помощьюряда методов. Классический метод ультрацентрифугирования позволяет определять размеры ДНК в пределах М = 2×105 — 1×109. Более длинные молекулы разрываются ДНК. при ультрацентрифугировании, поэтому их молекулярную массу определяют по вязкости.
|
|
|
Все внешние факторы, которые нарушают водородные связи или ослабляют стэкинг-взаимодействия, вызывают денатурацию ДНК. К ним относятся реагенты, подобные формамиду и мочевине, резкое изменение рН и ионной силы раствора повышение температуры выше 80°С. Денатурация ДНК — это любые изменения пространственного расположения цепей ДНК без разрыва ковалентных связей. Обычно при денатурации происходит нарушение водородных связей, или стэкинг-взаимодействий, или тех и других. Двойная спираль ДНК при этом полностью или частично разделяется на составляющие ее цепи.
Полная денатурация ДНК — это расхождение комплементарных цепей. При быстром охлаждении раствора денатурированной ДНК цепи остаются в разделенном состоянии. Однако если охлаждение проводить медленно, поддерживая в течение некоторого времени температуру немного ниже ТПл (этот прием называют отжигом), может восстановиться нативная структура. Восстановление первоначальной структуры нуклеиновой кислоты с более или менее полным восстановлением физических показателей и биологических свойств получило название ренатурации. Это процесс, противоположный денатурации.
Резкое подкисление или подщелачивание разрушает двухспиральную структуру ДНК, так как изменяется ионизация амино- и кетогрупп азотистых оснований, вследствие чего разрываются водородные связи. Растворы нативной ДНК оптически активны, обладают сильным правым вращением поляризованного света, которое уменьшается при денатурации.
Денатурация и ренатурация ДНК непрерывно протекают в клетке в процессе репликации ДНК, в процессе транскрипции. Проведение их в лаборатории позволяет изучать многие свойства молекул ДНК.
Третичная структура ДНК бактерий и вирусов. В частицах вирусов, клетках бактерий, как и в ядрах высших организмов, ДНК плотно «упакована», образует сложные структуры. Например, в хромосоме Е.сoli содержится ДНК длиной более 1 мм, хотя длина клетки не превышает 5 мкм. Одна из самых мелких молекул ДНК — вирусная, однако если ее вытянуть, то она будет во много раз длиннее, чем сам вирус
|
|
|
Цитоплазматическая ДНК. В цитоплазме эукариот содержится небольшое количество ДНК (менее 1% всей ДНК клетки). Она получила название цитоплазматической и отличается от ядерной ДНК по нуклеотидному составу и молекулярной массе. Заключенная в ней генетическая информация обусловливает цитоплазматическую наследственность. Цитоплазматические гены находятся в митохондриях и хлоропластах.
Наиболее полно изучена митохондриальная ДНК (мтДНК). В клетках животных она представлена двухцепочечными, обычно кольцевыми молекулами, длиной по окружности от 5 до 30 мкм. Молекулярная масса мтДНК у дрожжей, грибов, простейших (3—4) × 107, у высших животных до 107. В одной митохондрии может содержаться от 2 до 10 молекул ДНК, обычно они находятся в матриксе.
Все гены в мтДНК млекопитающих расположены исключительно компактно, почти без промежуточных нуклеотидных последовательностей, в то же время в дрожжевой мтДНК между генами находятся повторяющиеся некодирующие участки. МтДНК кодирует две рРНК митохондриальных рибосом, полный набор тРНК, необходимых для синтеза белка, и ограниченное число полипептидов, синтезируемых на полисомах в митохондриях. Полипептиды представляют собой субъединицы ферментативных комплексов внутренней мембраны митохондрий. Например, митохондриальную природу имеют в зависимости от объекта одна, две, а у дрожжей — три субъединицы АТФ-синтетазного комплекса, три субъединицы цитохромоксидазы и апофермент цитохрома 6. Остальные субъединицы этих комплексов кодируются ядерными генами и синтезируются в цитоплазме.
Бактериальные плазмиды. В цитоплазме многих бактерий кроме хромосомной ДНК содержатся добавочные маленькие кольцевые молекулы ДНК, присутствие которых необязательно для жизни клетки. Они получили название плазмид. Плазмиды способны автономно размножаться, стабильно наследуются, т. е. сохраняются без специальной селекции во внехромосомном состоянии. Некоторые плазмиды могут включаться в хромосому бактерии, они называются эписомами.
|
|
|
Плазмиды обладают как общими, так и специальными функциями. Всем плазмидам свойственна, например, способность к автономной репликации, а также свойство несовместимости (две близкородственные плазмиды не могут существовать в одной клетке).
Биологическая роль плазмид велика: они обеспечивают бактериям селективные преимущества в меняющихся условиях внешней среды. Благодаря способности к переносу и автономной репликации плазмиды широко используются в генетической инженерии.
Кроме бактерий, плазмиды иногда содержат синезеленые водоросли, а из эукариотических организмов — дрожжи.
Рибонуклеиновые кислоты
Гетерогенность молекул РНК. Содержащиеся в клетке РНК различаются размером, составом, функциями и локализацией. В цитоплазме содержится стабильная РНК нескольких видов: транспортная РНК (тРНК), матричная, или информационная (мРНК, или иРНК), рибосомная (рРНК). В ядре локализована ядерная РНК (яРНК), количестве которой составляет от 4 до 10% от суммарной клеточной РНК. В состав яРНК входит большое число молекул, различающихся по размерам и нуклеотидный последовательностям, существенно превышающее число различных молекул цитоплазматических мРНК.
Наряду с основными видами РНК из зараженных вирусами клеток можно выделить геномные РНК вирусов растений, некоторых вирусов бактерий (например, бактериофаг Q (3 кишечной палочки) и некоторых вирусов животных (вирус полиомиелита). Геномные РНК хранят и передают следующему поколению соответствующую генетическую информацию. Они относятся к самым крупным: их молекулярная масса достигает нескольких миллионов, а число нуклеотидов — десятков тысяч.
Молекула РНК в отличие от ДНК состоит (за редким исключением) из одной полинуклеотидной цепи. Полинуклеотидная цепь РНК, закручиваясь на себя, образует в палиндромных участках короткие двухспиральные «шпильки», в которых азотистые основания образуют комплементарные пары: Г с Ц, А с У. Это довольно прочные структуры, которые видны под электронным микроскопом.
Транспортная РНК. Транспортные РНК — самые мелкие молекулы РНК. Они включают в себя от 75 до 90 нуклеотидных единиц, М-23 000—30 000. тРНК составляют 10—20% суммарной РНК клетки. Их функция состоит в том, чтобы транспортировать аминокислоты в рибосомы и ставить их в определенные участки полипептидной цепи при ее биосинтезе. Таким образом, тРНК участвует в процессе трансляции, причем играет роль адаптора, т. е. своеобразного переводчика: переводит последовательность нуклеотидов в последовательность аминокислотных остатков белковой молекулы. Каждой из 20 аминокислот соответствует своя тРНК. Для некоторых аминокислот известно несколько тРНК. Например, существует пять различных тРНК, переносящих лей, и пять различных тРНК, переносящих сер. В то же время каждый вид тРНК переносит в рибосому только один вид аминокислоты, «свою» аминокислоту. В клетке присутствует до 60 разных видов тРНК.Кроме четырех обычных рибонуклеотидов (А, Г, Ц и У) в тРНК содержится много (8—19%) минорных нуклеотидов. Список минорных компонентов тРНК включает до 60 названий: различные метилированные аденины и гуанины, метилированные пиримидины (тимин,5-метилцитозин) и др. Не все они встречаются в какой-либо одной молекуле тРНК, но универсальными и наиболее распространенными являются псевдоуридин и дигидроуридин.
|
|
|
Молекула тРНК представляет собой одиночную полинуклеотидную цепь, закрученную «на себя». Она образует сложную пространственную структуру.
Вторичная структура тРНК характеризуется частичной спирализацией молекулы. В центре молекулы находится неспирализованная область. 3'- и 5'-Концы полинуклеотидной цепи спарены, образуют акцептирующий стебель. Это самый длинный спирализованный участок (7 пар). Он завершается на З'-конце в большинстве случаев неспаренной последовательностью ЦЦА. К 3'- или 2/-ОН-группе концевого аденозинового остатка присоединяется соответствующая аминокислота через свою СООН-группу, образуется аминоацил-тРНК.
Рис. 7. Структура транспортных РНК: / — общая схема строения, // — третичная структура
Метилированные и другие модифицированные нуклеотиды располагаются в тРНК в участках, не вовлеченных в образование водородных связей. Возможно, они играют некоторую роль в образовании третичной структуры тРНК.
Матричная (информационная) РНК. Матричная РНК образуется в процессе транскрипции. Она несет точную копию генетической информации, закодированной в определенном участке ДНК, а именно информации о последовательности аминокислот в белках. У прокариот матричные РНК (мРНК) образуются сразу в процессе транскрипции. В эукариотических клетках в процессе транскрипции вначале образуются про-мРНК. Затем протекает процессинг, в ходе которого первичные транскрипты превращаются в мРНК. Свое название матричная РНК получила в связи с той функцией, которую она выполняет в клетке: она служит матрицей, на которой синтезируется полипептидная цепь в рибосоме. Каждой аминокислоте соответствует в мРНК определенная тройка (триплет) нуклеотидов, называемая кодоном этой аминокислоты. Последовательность кодонов в цепи мРНК определяет последовательность аминокислот в белке. Поскольку мРНК несет наследственную информацию о первичной структуре белка, нередко ее называют информационной РНК (иРНК).
Структура рибосом и рибосомной РНК. Рибосомная (рибосомальная) РНК (рРНК) — это та основа, на которой располагаются белки, образуя рибосому. На электронных микрофотографиях рибосомы видны как плотные округлые гранулы приблизительно сферической формы. Число рибосом в клетке очень велико: у бактерий в среднем 104, в эукариотических клетках— 106. Рибосомы локализуются главным образом в цитоплазме, кроме того,— в ядре (особенно в ядрышке), митохондриях и хлоропластах.
По размерам и молекулярной массе все изученные до сих пор рибосомы делят на три группы. Первую группу образуют относительно мелкие (30x30x20 нм) бактериальные рибосомы.
Вторую группу образуют крупные (40×40×20 нм) рибосомы эукариотических клеток. Они имеют константу седиментации 80S и М≈4,5х106. Как и рибосомы первой группы, они состоят из двух субчастиц. Малая 405-субчастица содержит 18S РНК и 30 белков. Большая 60S-субчастица содержит 28S РНК, 5S РНК и 5,8S РНК, а также 41 белок (табл. 8).
Таблица 8. Размеры рибосомных РНК
| Объект исследования | Константа седиментации, S | Молекулярная масса | Число нуклеотидов |
| E.coli Печень крысы | 5,8 | 1,1 ×106 0,56 ×106 4,1 ×104 1,7 ×106 0,65 ×106 5 ×104 4 ×104 | 121 |
Третью группу составляют рибосомы митохондрий и хлоропластов эукариотических клеток. Рибосомы митохондрий в общем относятся к классу 70S. Однако они различаются по коэффициентам седиментации у разных групп эукариот. Так, у грибов и эвгленовых коэффициент седиментации митохондриальных рибосом составляет 70—74S, у высших животных — 55—60S, у высших растений — около 80S. Рибосомы хлоропластов, напротив, более однородны по этому признаку, коэффициент их седиментации равен 67—70S.
При синтезе белка определенное число рибосом (от 3 до 80— 100) прикрепляется к длинным нитевидным молекулам мРНК, образуя полисомы. Каждая рибосома в полисоме
способна синтезировать полную полипептидную цепь. Образование групп рибосом повышает эффективность использования мРНК, поскольку на ней может одновременно синтезироваться несколько идентичных полипептидных цепей. Полисомы находятся или в свободном состоянии, или в тесной связи с мембранами эндоплазматической сети. мРНК, кодирующие внутриклеточные белки, содержатся преимущественно в свободных полисомах, а мРНК, кодирующие секреторные белки,— в мембраносвязанных.
Биосинтез нуклеотидов
Пути синтеза мононуклеотидов. Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды могут синтезироваться de novo, т. е. из простых предшественников, а также непосредственно из готовых пуриновых и пиримидиновых оснований. Относительное значение этих двух путей существенно отличается для разных клеток. Так, в тканях млекопитающих нуклеотиды преимущественно синтезируются de novo, хотя в быстро растущих тканях образуются обоими путями. Напротив, для нормального роста и развития многих видов бактерий необходимо наличие в питательной среде готовых молекул пуринов или пиримидинов.
Биосинтез пуриновых нуклеотидов. Биосинтез пуринового кольца de novo протекает одинаково у разных видов живых существ: у бактерий, дрожжей, птиц, человека. Это один из многих примеров единства ряда основных биохимических процессов всего живого. Эксперименты с использованием изотопов позволили установить, из какого предшественника поступает каждый атом пуринового кольца (рис. 8).
Рис. 8. Происхождение атомов пуринового кольца
Таким образом, синтезируется не свободное азотистое основание, а его нуклеотид — инозиновая кислота. Инозиновая кислота служит предшественником всех остальных пуриновых нуклеотидов. Так, адениловая кислота (АМФ) образуется в результате аминирования ИМФ, аминогруппа поставляется аспарагиновой кислотой. Образование гуаниловой кислоты (ГМФ) из ИМФ является двухстадийной реакцией. Первая стадия состоит в окислении ИМФ до ксантозин-5'-фосфата (КМФ). Затем происходит его аминирование, и образуется ГМФ. Донор аминогруппы, повидимому, различен у ряда организмов: у птиц и млекопитающих донором служит глицин, в бактериальных системах — NH3.
Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов. Применение метода изотопов позволило выяснить происхождение отдельных звеньев пиримидинового ядра.
Первым этапом в синтезе пиримидиновых нуклеотидов является образование карбамоилфосфата из NH3 и СО2. Карбамоилфосфат вступает в реакцию с аспаргин и под действием аспартат-карбамоилтрансферазы превращается в карбамоиласпартат. Последний подвергается циклизации и окислению, в результате чего образуется оротовая кислота, т. е. завершается формирование пиримидинового кольца.
Превращение урацила в цитозин происходит на уровне нуклеозидтрифосфатов. Оно осуществляется под действием фермента ЦТФ-синтетазы: УТФ + NН3+АТФ→ЦТФ+АДФ + Фн. Тиминовые нуклеотиды образуются в результате метилирования дезоксиуридинмонофосфата. Реакция катализируется ферментной системой, которую часто называют тимидилат-синтазой. Процесс весьма сложен и протекает в несколько стадий. Источником одноуглеродного фрагмента при С-5 служит кофермент N5,N10-метилентетрагидрофолиевая кислота.
Биосинтез дезоксирибонуклеотидов. Превращение рибозы в дезоксирибозу происходит на нуклеотидном уровне. Механизм этого процесса был выяснен при изучении восстановления рибонуклеотидов в экстрактах Е. coli. Фермент рибонуклеозид-дифосфатредуктаза катализирует восстановление всех четырех рибонуклеозиддифосфатов — АДФ, ГДФ, ЦДФ, УДФ в их дезоксипроизводные дАДФ, дГДФ, дЦДФ, дУДФ. Источник восстанавливающей способности фермента in vivo неизвестен.
In vitro активны два донора водорода. Один из них — низкомолекулярный серосодержащий белок тиоредоскин, две SH-группы которого окисляются с образованием дисульфидного мостика. Вторым донором водорода может служить восстановленный глутатион. Редуктазные системы, выделенные из различных животных клеток, сходны с описанной системой Е. coli.
|
|
|
