 |
Положения, выносимые на защиту
|
|
|
|
На правах рукописи
СТЕФАНОВА НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА
ОСОБЕННОСТИ ПОВЕДЕНИЯ КРЫС OXYS
КАК ПРОЯВЛЕНИЕ ИХ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОГО СТАРЕНИЯ
14.01.30 — геронтология и гериатрия
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
санкт-петербург 2011
СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений….……………………………………………………………… 3
Введение….…………………………………………………………………………... 4
Глава 1. Обзор литературы………………………………………………………11
1.1. Изменения поведения как проявление старения мозга…………………. 11
1.1.1. Изменения поведения в онтогенезе………………………………….. 11
1.1.2. Изменения поведения при физиологическом старении и нейродегенеративных расстройствах………………………………... 15
1.2. Возможные механизмы возрастных изменений…………………………. 18
1.3. Окислительный стресс и старение мозга………………………………… 24
1.3.1.Роль активных форм кислорода в физиологических процессах…… 25
1.3.2. Окислительный стресс в механизмах старения и
патогенезе, связанных с ним нейродегенеративных заболеваний... 30
1.4. Антиоксиданты как геропротекторы……………………………………... 34
1.4.1. Адресованные в митохондрии антиоксиданты –
новый класс биологически активных молекул……………………... 45
1.5. Крысы OXYS – модель преждевременного старения и
связанных с ним изменений мозга…………………………………... 50
Заключение………………………………………………………………… 57
Глава 2. Материалы и методы исследования …………………………………. 58
2.1.Животные и методы воздействия на них…………………………………. 58
2.1.1. Оценка возрастных изменений поведения крыс OXYS и Вистар… 58
2.1.2. Магнитно-резонансная томография…………………………………. 59
|
|
|
2.1.3. Офтальмологические осмотры………………………………………. 60
2.1.4. Влияние антиоксидантов на поведение……………………………... 60
2.2.Статистическая обработка результатов………………............................... 61
Глава 3. Результаты исследования ……………………………………………... 62
3.1. Изменения поведения крыс OXYS и Вистар с возрастом………………. 62
3.1.1. Тест «открытое поле»……………………………………………… 62
3.1.2. Приподнятый крестообразный лабиринт………………………… 64
3.1.3. Водный лабиринт Морриса………………………………………... 66
3.2. Поведение крыс OXYS и развитие катаракты и ретинопатии………….. 68 3.3.Магнитно-резонансная томография мозга………………………………... 693.4. Влияние антиоксидантов на поведение
крыс OXYS и Вистар……………………………………………………… 73
3.4.1. Влияние антиоксидантов на поведение
молодых крыс OXYS и Вистар…………………………………… 73
3.4.2. Влияние длительного приёма SkQ1
на поведение крыс OXYS и Вистар……………………………… 79
3.4.3. Влияние SkQ1 на поведение годовалых крыс OXYS и Вистар…. 82
Глава 4. Обсуждение результатов ………………………………………………. 88
Выводы… …………………………………………………………………………. 106
Список литературы… …………………………………………………………… 108
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ - аденозинтрифосфатсинтаза
АФК - активных форм кислорода
ВМД - возрастная макулярная дегенерация
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
иРНК - информационная рибонуклеиновая кислота
МitoQ - убихинон-децил-трифенилфосфоний
МРТ - магнитно-резонансная томография
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СОД – супероксиддисмутаза
CoQ10 - коэнзим Q10
SAMP - senescence-prone accelerated mice
SkQ1 - пластохинонил-децил-трифенилфосфоний
UCP - митохондриальная мембрана
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Снижение функциональных возможностей мозга, в том числе способности к обучению и памяти, рост вероятности развития нейродегенеративных заболеваний - неизбежные проявления старения, критический возраст манифестации и масштабы которых существенно различаются. Актуальность выяснения причин раннего старения мозга и поиск способов его профилактики приобрели особую актуальность в связи с постарением населения развитых стран. Механизмы старения и патогенез связанных с ним нейродегенеративных заболеваний тесно связаны с окислительным стрессом – нарушением баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Вероятность его развития с возрастом растет вследствие усиления образования АФК и/или снижения способности клеток к их нейтрализации. Это приводит к накоплению в клетках мозга окислительных повреждений макромолекул, способных приводить к деполяризации мембран нейронов, изменению порога их чувствительности к действию нейромедиаторов, к нарушению оптимальных условий функционирования рецепторов, транспортных и сигнальных систем и, как следствие, к нарушению функций мозга, в том числе – способности к обучению, памяти [Droge W., 2002; Valko M. et al., 2007; Gerich F.J. et al., 2009]. Стрессы, неблагопpиятные воздействия среды, неполноценное питание, заболевания, активирующие свободнорадикальные процессы, способствуют раннему старению организма [Mattson M.P., 2001]. Закономерно со времен формулировки Д.Харманом [1958] свободнорадикальной теории старения в качестве геропротекторов используют антиоксиданты, приём которых нацелен на длительное применение в молодом и зрелом возрасте. Доказана способность антиоксидантов замедлять развитие возрастных изменений мозга, проявлений таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона [Navarro А. et al., 2005]. В то же время в последние годы существенно расширились представления об участии АФК в физиологических процессах. Они не только участвуют в метаболизме клеток в качестве промежуточных продуктов синтеза и обеспечивают микробицидность фагоцитирующих клеток. Как сигнальные молекулы АФК регулируют многие физиологические процессы, запускают клеточный ответ, направленный на мобилизацию функциональных резервов, участвуют в процессах нейрональной пластичности [Hu H.J. et al., 2007]. В этой связи целесообразность подавления свободных процессов в организме, особенно здоровом, уже не представляется абсолютно бесспорной. Поднимается вопрос о том, что необоснованные добавки антиоксидантов могут принести больше вреда, чем пользы. В этом убеждают результаты недавних эпидемиологических исследований, показавших, что на фоне длительного приёма больших доз антиоксидантов растет вероятность развития ряда ассоциированных со старением заболеваний [Evans J., 2008; Dotan Y. et al., 2009; Jonson E.J., 2010]. Тем не менее, количество новых препаратов со свойствами антиоксидантов растет. Объективную оценку их эффективности затрудняют индивидуальные особенности развития возрастных дисфункций, различия в характере питания и базовой обеспеченности людей антиоксидантами.
|
|
|
|
|
|
Объективно оценить эффективность терапевтических воздействий позволяют биологические модели. До недавнего времени единственной общепризнанной моделью преждевременного старения была линия мышей SAMP (senescence-prone accelerated mice), сублинии которой различаются по ряду характеристик, в том числе - по характеру расстройств эмоциональной сферы, природе нарушений когнитивных функций [Takeda Т.,1998, 2009]. В последние годы получены убедительные аргументы в пользу того, что уникальной моделью для изучения механизмов старения может служить созданная в Институте цитологии и генетики СО РАН линия преждевременно стареющих крыс OXYS. Линия создана селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы [Соловьёва Н.А. и др., 1975]. В 5 первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой, в дальнейшем проводился отбор по ранней спонтанной катаракте, сцеплено с которой животные унаследовали синдром преждевременного старения. Помимо катаракты он проявляется снижением максимальной продолжительности жизни и ранним развитием ассоциированных со старением заболеваний: ретинопатии, остеопороза и артериальной гипертензии [Колосова Н.Г. и др., 2003; Муралева Н.А. и др., 2010; Bobko А.А. et al., 2005]. Одно из ранних проявлений старения мозга у людей и животных - нарушение краткосрочной памяти [Huppert F.A., 1991]. К моменту постановки задач настоящего исследования её снижение, а также снижение поисково-исследовательской активности и повышенная тревожность были выявлены у трёхмесячных крыс OXYS [Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г., 2000]. Оставалось не ясным, проявляются эти признаки у крыс OXYS с рождения, развиваются в связи с изменениями зрительной функции или становятся проявлениями ускоренного старения мозга. Всесторонняя характеристика линии крыс OXYS как потенциальной модели ускоренного старения мозга позволит использовать этих животных для исследования его механизмов и оценки эффективности терапевтических воздействий, в том числе – длительного приёма антиоксидантов. Наряду с традиционными антиоксидантами – витамином Е [Halliwell В., 2006] и обладающими высокой антирадикальной активностью флавоноидами черники [Costantino L. et al., 1992; Joseph J.A. et al., 1999] в работе оценивались эффекты соединений принципиально нового класса – антиоксидантов, способных проникать и накапливаться в митохондриях: убихинон-децил-трифенилфосфония [МitoQ, Murphy M.P., 2001] и пластохинонил-децил-трифенилфосфония [SkQ1, Скулачев В.П., 2007].
|
|
|
Целью работы явилось исследование возрастных изменений поведения крыс OXYS с признаками преждевременного старения и крыс Вистар с нормальным темпом старения и оценка возможности влиять на них с помощью антиоксидантов. При этом были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить динамику возрастных изменений поведения крыс OXYS с признаками преждевременного старения и крыс Вистар с нормальным темпом старения в серии поведенческих тестов:
а) тревожного поведения в приподнятом крестообразном лабиринте;
б) моторно-исследовательского поведения в тесте «открытое поле»;
в) пространственной памяти в водном тесте Морриса.
2. Изучить структурно-функциональные характеристики головного мозга крыс OXYS с признаками преждевременного старения разного возраста методами магнитно-резонансной томографии.
3. Исследовать возможную связь изменений поведения крыс OXYS с развитием катаракты и ретинопатии и вызванными ими нарушениями зрительной функции.
4. Оценить влияние на поисково-исследовательскую активность и тревожность крыс OXYS с признаками преждевременного старения и Вистар с нормальным темпом старения профилактического приема антиоксидантов: витамина Е, флавоноидов черники и адресованных в митохондрии антиоксидантов SkQ1 и MitoQ.
5. Оценить влияние SkQ1 на двигательную, исследовательскую активность, тревожность и способность к пространственной памяти крыс OXYS и Вистар с выраженным возрастным снижением этих показателей.
|
|
|
Научная новизна работы. В работе впервые дана характеристика линии крыс OXYS как модели для исследования механизмов ускоренного старения мозга. Показано, что у крыс OXYS, как и у крыс Вистар, с возрастом двигательная и исследовательская активность снижается, а тревожность растет, но ускоренными темпами. Установлено, что повышенный уровень тревожности и сниженная двигательная и исследовательская активность развиваются у крыс OXYS к возрасту 3 месяцев, нарушения пространственной памяти – к возрасту 12-14 и не являются врожденными, а развиваются на фоне нейродегенеративных изменений мозга. Развитие катаракты и дистрофии сетчатки оказывают влияние на поведение крыс OXYS, но его характер зависит от возраста и выраженности патологических изменений. В возрасте 3 мес. у крыс OXYS отсутствует связь между поисково-исследовательской активностью и выраженностью патологических изменений сетчатки и хрусталиков. Начиная с возраста 12 мес., напротив, крысы OXYS с выраженными патологическими изменениями, предполагающими нарушение зрительной функции, демонстрируют более высокую тревожность и пассивный характер поведения.
Впервые выявлена способность антиоксидантов: витамина Е, флавоноидов черники, адресованных в митохондрии антиоксидантов MitoQ и SkQ1 – изменять уровень тревожности и влиять на поисково-исследовательскую активность молодых животных. Показано, что длительный профилактический приём SkQ1 (с 1,5 до 12 мес.) замедлил снижение способности к обучению, но при этом повысил тревожность крыс OXYS. Не изменив тревожность, SkQ1 предупредил снижение поисково-исследовательской активности у крыс Вистар. Выявлена способность SkQ1 (приём с 12 до 15 мес.) повышать до уровня молодых животных поисково-исследовательскую активность и снижать тревожность у крыс Вистар и OXYS с выраженными возрастными изменениями поведения. Впервые установлено, что эффекты антиоксидантов зависят от генотипа, возраста животных, дозы и длительности приёма.
Практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс OXYS критериям модели ускоренного старения мозга, возможности её использования для исследования этиологии и патогенеза связанных со старением нейродегенеративных процессов, в том числе на ранних доклинических стадиях их развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику возрастных изменений мозга. Выявленные в работе эффекты витамина Е, флавоноидов черники, MitoQ и SkQ1 на крыс OXYS и Вистар расширяют представления о диапазоне возможных эффектов антиоксидантов, демонстрируют необходимость всесторонней оценки последствий их длительного приёма с учётом возможных неоднозначных эффектов на поведение и эмоциональное состояние организма.
Положения, выносимые на защиту
1. Повышенный уровень тревожности, сниженная двигательная и исследовательская активность, нарушение пространственной памяти у крыс OXYS не являются врожденными, а становятся проявлениями их преждевременного старения и развиваются на фоне нейродегенеративных изменений мозга.
2. Линия крыс OXYS - адекватная модель ускоренного старения мозга и может использоваться для исследования его механизмов и оценки эффективности терапевтических воздействий.
3. Антиоксиданты влияют на поведенческий стереотип и уровень тревожности животных, их эффекты зависят от генотипа, возраста, дозы и длительности приёма.
|
|
|
