Глава 4. Обсуждение результатов

При старении снижение функциональных резервов и адаптивных возможностей организма происходит постепенно. Множественность проявлений старения затрудняет отделение причин от эффектов, оценку его темпов и прогноз развития связанных с ним заболеваний. Свойственные стареющим людям и животным структурно-функциональные изменения мозга лежат в основе развития ассоциированных со старением нейродегенеративных заболеваний, но не всегда приводят к их развитию [Barreto G. et al., 2010; Shoji H., Mizoguchi K., 2010; Egashira N. et al., 2010]. Механизмы, запускающие переход обычных возрастных изменений мозга в патологические процессы и способствующие его ускоренному старению, до настоящего времени исследованы недостаточно. В значительной степени это обусловлено невозможностью проведения исследований на ранних стадиях развития нейродегенеративных процессов, которые протекают у людей бессимптомно. Наши исследования показали, что уникальные возможности для выяснения механизмов возрастных изменений мозга, оценки эффективности новых способов терапевтических воздействий открывает использование генетической модели преждевременного старения - линии крыс OXYS.

Особенности возрастных изменений поведения крыс OXYS нами были выявлены впервые и рассматриваются как одно из проявлений их преждевременного старения. Сравнительный анализ результатов исследования поведения в возрасте 1, 3, 12, 16 и 24 мес. в тесте «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» выявил критический возрастной период, в который формируются ярко выраженные межлинейные различия в поведении. В возрасте 1 мес. между крысами OXYS и Вистар значимые различия в уровне тревожности и моторно-исследовательской активности отсутствуют. Такие различия: пассивный тип поведения и повышенная тревожность, - появляются к возрасту 3 мес. и в дальнейшем усиливаются. При этом способность к обучению в водном лабиринте Морриса у трёхмесячных крыс Вистар и OXYS не различалась.

Полученные нами данные согласуются с результатами многих авторов: с возрастом двигательная активность и исследовательское поведение у грызунов, в том числе у крыс разных линий, постепенно снижаются [Torras-Garcia M. et al., 2005; Altun M. et al., 2007; Chen G.H. et al., 2007; Schulz D. et al., 2007; Cerqueira J.J., Almeida A., 2009]. Динамика возрастных изменений поведения крыс обеих линий была схожей, но темпы снижения были выше у крыс OXYS. К возрасту 3 мес. локомоторная и исследовательская активность крыс OXYS в тесте «открытое поле» резко снижалась по сравнению с месячными животными и затем – незначительно к возрасту 12 мес., в то время как у крыс Вистар её снижение с возрастом происходило постепенно. В приподнятом крестообразном лабиринте темп снижения двигательной и исследовательской активности крыс обеих линий был аналогичен тому, что и в тесте «открытое поле», тогда как уровень тревожности крыс OXYS с возрастом снижался постепенно, оставаясь выше, чем у крыс Вистар. У последних уровень тревожности резко повысился только к возрасту 12 мес.

Помимо традиционных показателей тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте, для крыс OXYS оказалось характерным проявление неспецифического поведения - реакции фризинга - замирания в ответ на стрессовую ситуацию. Такая реакция впервые регистрируется у крыс OXYS уже в возрасте 3 мес. С возрастом процент животных, у которых наблюдалось это проявление неспецифического поведения, увеличивалось, при этом реакцию фризинга крысы OXYS демонстрировали как в приподнятом крестообразном лабиринте, так и в тесте «открытое поле».

Принципиально важно, что также к возрасту 3 мес. практически у всех крыс OXYS развиваются признаки катаракты и ретинопатии, с которыми могли бы быть связаны изменения поведения. Однако патологические изменения в этом периоде не достигают стадий, предполагающих существенные изменения качества зрения. Очевидно, поэтому проведенный нами корреляционный анализ не выявил связи между выраженностью патологических изменений хрусталиков и сетчатки и поведением крыс OXYS. Отрицательная связь между показателями моторно-исследовательского поведения и стадиями катаракты и ретинопатии появляется у крыс OXYS с выраженными патологическими изменениями, предполагающими нарушение зрительной функции – у животных в возрасте 12-14 месяцев и старше. Крысы с более выраженными стадиями катаракты и ретинопатии, предполагающими снижение зрительной функции, демонстрировали более пассивный характер поведения. Поэтому исследование ранних изменений поведения как возможного проявления преждевременного старения мозга крыс OXYS выполнено на животных в возрасте 1, 3 и 12 мес.

В то же время мы не выявили связи между состоянием сетчатки и хрусталиков и пространственной ориентацией в водном лабиринте Морриса у крыс OXYS вплоть до возраста 16 мес. По-видимому, это обусловлено тем, что она определяется не только остротой зрения и использованием внешних ориентиров, но и счислением пути, запоминанием собственного положения в пространстве [DiLoreto D.A. et al., 1998]. В таком случае снижение способности к обучению в водном лабиринте Морриса крыс OXYS в 12-16 мес., вероятно, также связано, прежде всего с нейродегенеративными изменениями мозга.

Таким образом, формирование пассивного типа поведения у крыс OXYS в возрасте 3 мес. не связаны с нарушением зрительной функции. По времени они совпали с появлением в головном мозге крыс OXYS выявленных нами методами МРТ ранних нейродегенеративных изменений – появление очагов демиелинизации. Демиелинизация - разрушение или нарушение формирования миелиновой оболочки нервных волокон – происходит в определенных структурах головного мозга, как при естественном старении, так и при развитии нейродегенеративных заболеваний, но масштабы изменений при этом существенно различаются [Andrews-Hanna J.R. et al., 2007]. С возрастом очаги демиелинизации появились и у крыс Вистар, но в 12 и 24 мес. количество очагов было меньше, чем у OXYS. О ранних нейродегенеративных изменениях свидетельствует и увеличение объема желудочков мозга, которое может быть обусловлено дисбалансом между выработкой ликвора и его резорбцией, характерным для ряда нейродегенеративных состояний. С их появлением совпадает по времени формирование пассивного поведенческого стереотипа у крыс OXYS, в то время как снижение способности к обучению в водном лабиринте Морриса проявляется позже на фоне прогрессирующих нейродегенеративных изменений и хронической ишемии.

В отношении возрастных изменений тревожности в литературе не существует единого мнения. По мнению одних авторов, тревожность с возрастом увеличивается [Frussa-Filho R. et al., 1991; Shoji H., Mizoguchi K., 2010; Egashira N. et al., 2010]. По мнению других [Torras-Garcia M., 2005; Schulz D. et al., 2007] - старение грызунов связано со снижением не только двигательной активности, но и тревожности. Как показали Chen G.H. и соавторы [2007], тревожность преждевременно стареющих мышей SAMP8, для которых характерны ранние нейродегенеративные изменения мозга, зависела не только от возраста, но и поведенческого теста. Так, в приподнятом крестообразном лабиринте с возрастом тревожность росла, но на уровне тенденции, в то время как в тесте «открытое поле» не менялась. В то же время ранее сообщалось [Chen GH et al., 2005], что с возрастом растет тревожность как преждевременно стареющих мышей SAMP8, так и мышей контрольной линии SAMR1 с нормальным темпом старения, но у первых - существенно быстрее. При этом уровень и темпы роста тревожности зависели от пола и были выше у самцов. Возможно, противоречия связаны с тем, что изменения моторно-исследовательского поведения с возрастом происходят параллельно с изменением тревожности и неизбежно влияют на характер поведения животных. В этой ситуации для корректной оценки тревожности животных необходимо комплексно анализировать все составляющие поведения.

Тревожность - эмоциональное состояние, возникающее в ситуациях неопределенной опасности и проявляющееся в ожидании неблагополучного развития событий, которое в природе помогает приспособлению к меняющимся условиям среды. Однако высокая базовая тревожность может становиться причиной развития чрезмерной стресс-реактивности и повреждений организма. Хорошо известно, что фактором риска развития ранних нейродегенеративных проявлений является стресс, особенно хронический: повышение активности гипоталамо-гипофизирно-надпочечниковой оси, сопровождающееся повышением уровня глюкокортикоидов в крови, способствует развитию у пожилых людей нейродегенерации и может становиться основой нарушений памяти [Patel N.V., Finch C.E., 2002]. Старение людей и животных сопровождается повышением чувствительности к анксиогенным воздействиям и снижением адаптивных резервов организма, его устойчивости к стрессам [Frussa-Filho R. et al., 1992]. Существуют убедительные доказательства того, что гиперреактивность на стресс может приводить к сокращению продолжительности жизни и способствовать ранним нейродегенеративным расстройствам при старении [Dellu F. et al., 1994].

Проведенное нами ранее [Колосова Н.Г., Трофимова Н.А.и др., 2005] сравнение реакции на стресс - иммобилизацию в ограничивающих подвижность клетках - трёхмесячных крыс OXYS и Вистар показало, что уровень кортикостерона в плазме крови крыс OXYS незначительно, но стабильно выше, а содержание метаболитов NO существенно ниже, чем у крыс Вистар. Стресс повысил артериальное давление у всех животных, но у контрольных и опытных крыс OXYS оно было наиболее высоким. Наши исследования показали, что уровень окислительных повреждений белков и липидов в мозге интактных крыс OXYS и Вистар одинаков. В то же время повышенная активность СОД – фермента, экспрессия которого возрастает в ответ на усиление генерации АФК, в комплексе со сниженным уровнем глутатиона могут рассматриваться как косвенный показатель повышенного фона образования кислородных радикалов и напряжения в системе антиоксидантной защиты в мозге крыс OXYS. Её недостаточность проявляется при дополнительной нагрузке – иммобилизационном стрессе, следствием которого становится накопление окислительных повреждений белков и липидов. По-видимому, повышенная тревожность, высокое на фоне недостаточности NO артериальное давление, повышенный уровень кортикостерона, проявляющаяся при стрессе несостоятельность систем антиоксидантной защиты и тем более комплексное действие всех этих факторов способствуют развитию ранних нейродегенеративных процессов в мозге крыс OXYS.

Можно полагать, что повышенная тревожность и стресс-реактивность способствуют и выявленному нами ускоренному снижению половой мотивации у самцов крыс OXYS. С возрастом мотивационное поведение снижается у крыс обеих линий, однако у крыс OXYS - более высокими темпами по сравнению с крысами Вистар [Белоусова И.И., Амстиславская Т.Г., Стефанова Н.А. и др., 2009]. В возрасте 3 и 6 мес. межлинейные различия в выраженности половой мотивации отсутствовали. К 14 мес. у крыс OXYS она снижалась и становилась существенно ниже, чем у крыс Вистар. У последних значимое снижение мотивационной составляющей полового поведения отмечалось только к возрасту 18 мес. Причиной раннего снижения половой мотивации самцов OXYS могли быть как связанные со старением изменениями в центральной нервной системе, так и нарушения функционирования периферических репродуктивных органов. Тем не менее, в возрасте 14 мес. снижения гормонального ответа на сексуальный стимул у самцов OXYS не выявлено, как и снижения способности клеток семенников к нормальному мейозу. В связи с этим можно предположить, что значительные изменения мотивационной составляющей полового поведения на фоне отсутствия органических нарушений могут быть связаны с повышенной тревожностью крыс OXYS.

В исследованиях, направленных на изучение когнитивных функций мозга, широко используется водный лабиринт Морриса, позволяющий оценивать способность к обучению и памяти грызунов при нарушениях пространственной памяти [Brandeis R. et al., 1989; Moghaddam M., Bures J., 1997] и в процессе старения [Joseph J.A. et al., 1999; Kiray M. et al., 2006; Küçük A. et al., 2008]. Известно, что старые крысы демонстрируют сниженную пространственную память в лабиринте Морриса по сравнению с молодыми, тогда как молодые и среднего возраста животные не отличаются друг от друга [Blalock E.M. et al., 2003]. Исследование пространственной памяти крыс OXYS и Вистар в водном лабиринте Морриса, выполненное нами на животных в возрасте 3, 12 и 16 месяцев показало, что способность к обучению у крыс Вистар с возрастом не изменялась, в то время как у крыс OXYS снижалась начиная с возраста 12 мес., указывая на постепенное ухудшение когнитивных функций мозга. Однако существенные нарушения временной организации обучения и памяти в водном лабиринте Морриса были выявлены у крыс OXYS только в возрасте 16 мес.

Такие результаты в целом согласуются с полученными ранее данными о том, что способность к обучению условной реакции пассивного избегания при её однократном предъявлении в возрасте 3 мес. у крыс OXYS снижена по сравнению с крысами Вистар. [Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г., 2000]. Возможно, что, как и у стареющих людей, у крыс OXYS прежде всего страдает краткосрочная память в условиях однократного предъявления стимула. Однако различия в возрастных проявлениях нарушения способности к обучению крыс OXYS могут быть связаны с не одинаковой «жесткостью» тестов, поскольку, известно, что на процессы обучения и памяти влияют эмоциональный фон и тревожность. Как отмечалось выше, критический возраст изменения поведенческого стереотипа у крыс OXYS совпадает по времени с другими проявлениями преждевременного старения: развитием ретинопатии и катаракты, ростом артериального давления на фоне ускоренной инволюции тимуса и снижения активности Т-клеточного звена иммунной системы [Маркова Е.В. и др., 2003; Obukhova L.A., 2009]. Параллелизм возрастных изменений функциональной активности иммунной системы и ориентировочно-исследовательского поведения продемонстрирован в ряде работ [Larson S.J., 2002]. Однако даже существование корреляционных связей не может рассматриваться как доказательство прямого влияния изменений в иммунной системе на проявления нейронального старения. О связи изменений поведения крыс OXYS со снижением активности иммунной системы свидетельствует то, что стимуляция клеточного звена иммунного ответа введением вакцины БЦЖ вызвала дозозависимое увеличение поисково-исследовательской активности крыс OXYS в тесте «открытое поле» до уровня, не отличающегося достоверно от свойственного крысам Вистар. Возможность коррекции изменений поведения стимуляцией клеточных иммунных реакций - прямое доказательство вовлечения нейроиммунных взаимодействий в процесс старения [Markova E.V., et al., 2009], в нашем случае – преждевременного старения крыс OXYS.

Как известно, в патогенезе нейродегенеративных процессов ключевую роль играют окислительный стресс и ишемия. Преждевременное старение крыс OXYS ранее связывали с «врожденной гиперпродукцией свободных радикалов», которая и явилась ключевой характеристикой при регистрации линии в международной базе данных «Rat genome». В организме баланс между образованием и элиминацией АФК определяется редокс-регуляцией - динамическим процессом, обеспечивающим гомеостаз. Старение организма сопровождается развитием закономерных изменений этого баланса, которые могут быть как причиной, так и следствием возрастных структурно-функциональных изменений мозга. Развитие этих признаков преждевременного старения у крыс OXYS опережает по времени проявления дисбаланса в редокс-регуляции и накопление маркеров окислительного стресса, которое, можно полагать, компенсируется повышенной активностью СОД [Колосова Н.Г. и др., 2004; Kolosova N.et al., 2006; Scheglova et al, 2006]. Однако уже в возрасте 2 мес. у крыс OXYS повышен уровень окисленных липидов в структурах мозга, связанных с обучением и памятью: в среднем мозге, гиппокампе, прилежащих ядрах и стриатуме [Колосова Н.Г. и др., 2002]. Возможно, развитие ранних нейродегенеративных процессов у крыс OXYS связано с тем, что становление мозга происходит на фоне гипоксии, обусловленной задержкой формирования микроциркуляторного русла. В пользу этого свидетельствует снижение в полтора раза (по сравнению с крысами Вистар) митотической активности эндотелия сосудов пиальной оболочки больших полушарий мозга крыс OXYS в период интенсивного развития мозга в постнатальный период. При этом отставание выявлено в формировании как артериальных, так и венозных микрососудов [Korbolina E.E., Trofimova N.A. et al., 2007]. О системности таких отклонений свидетельствует то, что аналогичная ситуация выявлена и в брыжейке тонкой кишки. К концу первого месяца жизни различия в скорости пролиферации эндотелия сосудов сглаживаются, но при этом в последней декаде развиваются свойственные для адаптации к тканевой гипоксии изменения энергетического метаболизма: накопление фосфокреатина и его повышенный расход на синтез АТФ [исследовались методами ЯМР-томографии, Sergeeva et al., 2006]. С возрастом адаптивные резервы истощаются и у годовалых крыс OXYS методами МРТ выявляются признаки хронической гипоксии, характерные для ишемии изменения церебрального кровотока [Агафонова И.В. и др., 2007]. Хроническая ишемия неизбежно способствует прогрессированию нейродегенеративных изменений, что и было доказано нами при МРТ исследовании мозга годовалых и, особенно, двухгодовалых крыс OXYS.

Принципиально важно, что именно к возрасту 12 мес. у крыс OXYS снижается способность к обучению в водном лабиринте Морриса и прогрессируют нейродегенеративные изменения. Наряду с увеличением количества очагов демиелинизации, субарахноидального ликворного пространства следует особо отметить факт уменьшения на 4% объема головного мозга годовалых крыс OXYS по сравнению с трёхмесячными животными этой линии (таблица 3). У крыс Вистар за этот период объем мозга также на 4% увеличился. Известно, что уменьшение объема головного мозга может способствовать развитию нейродегенеративных расстройств [de la Torre J.C., 2000; Gökcay A. et al., 2002; Díez-Vives C. et al., 2009]. Важно отметить, что к возрасту 12 мес. масса тела крыс OXYS достигает своего максимума и ещё не начинает снижаться, что характерно при старческих процессах. Следовательно, уменьшение объема мозга крыс OXYS к этому возрасту, вероятно, свидетельствует о прогрессирующих нейродегенеративных изменениях. Очаговые изменения выявлялись в основном в перивентрикулярных отделах. Такие изменения белого вещества, особенно около передних рогов боковых желудочков, являются вторичными, возможно, они возникли вследствие изменения ликвородинамики в головном мозге. Объем ликвора субарахноидальных пространств у крыс OXYS в этом возрасте был меньше, чем у крыс Вистар. В то же время, уже в возрасте 3 мес. у крыс OXYS выявляются признаки гидроцефалии боковых желудочков головного мозга. У крыс Вистар объем ликвора субарахноидальных пространств к возрасту 12 мес. не изменился, а у крыс OXYS он увеличился за счёт расширения наружного субарахноидального пространства долей, обусловленного корковой атрофией. Как известно, избыточное скопление ликвора вызывает повышение его давления на вещество головного мозга и может приводить к развитию внутричерепной гипертензии. У крыс OXYS всех возрастных групп увеличена удельная площадь боковых желудочков мозга, отражающая их объем, увеличение которого могло быть связано с дисбалансом между выработкой ликвора и его резорбцией, характерным для нейродегенеративных состояний.

В целом полученные в настоящем исследовании и ранее данные убеждают в том, что развитие характерных особенностей поведения и нарушение способности к обучению у крыс OXYS связаны с развитием нейродегенеративных изменений и становятся проявлениями преждевременного старения их мозга. Центральным механизмом ассоциированного с возрастом угасания функций мозга и развития нейродегенеративных заболеваний является окислительный стресс. В настоящем исследовании убедительным аргументом в пользу связи преждевременного старения мозга крыс OXYS с окислительным стрессом стало доказательство возможности влияния на его проявления с помощью антиоксидантов.

Использование антиоксидантов в качестве нейропротекторов основано на несомненном участии окислительного стресса в патогенезе нейродегенеративных заболеваний и возрастных изменений функций мозга. Однако при всей очевидности их высокой эффективности в острых ситуациях, оценить результаты профилактического приема антиоксидантов достаточно сложно. Исследователи, как правило, не подозревают, что антиоксиданты способны не только предотвратить вызванные окислительным стрессом нарушения нейрональных функций, но и влиять на поведенческий стереотип здорового организма.

Мы исследовали влияние на поведение крыс OXYS и Вистар широко используемых в медицинской практике витамина Е и экстракта черники, обладающего исключительно высокой антирадикальной активностью [Katsube N. et al., 2003]. Приём с кормом экстракта черники с возраста 1,5 мес. в течение 45 дней предупредил развитие характерных для крыс OXYS поведенческих признаков в критический период их развития. В результате локомоторная активность крыс OXYS снижалась незначительно, а уровень тревожности не отличался от такового крыс Вистар. Возможность флавоноидов черники влиять на особенности поведения крыс OXYS не только подтвердила связь их патогенеза с окислительным стрессом, но явилась также аргументом в пользу адекватности модели. Физиологические эффекты флавоноидов, как правило, связывают с их антиоксидантным и антирадикальным эффектами, однако новые данные указывают на то, что механизм их действия может выходить за рамки этих свойств. Полагают, что мишенью флавоноидов в мозге являются астроциты – клетки астроглии, обеспечивающие структурную, метаболическую и трофическую поддержку нейронов. Изменениям именно этих клеток в течение последних нескольких лет отводится ключевая роль в повреждении нейронов при развитии нейродегенеративных заболеваний и травмах головного мозга[Nones J. et. al., 2010]. Кроме того, флавоноиды черники способны препятствовать тромбообразованию, улучшать микроциркуляцию и способствовать, таким образом, регенерации сосудов [Harborne J., Williams C., 2002]. В то же время профилактический прием витамина Е – антиоксиданта широкого спектра действия, «работающего» на всех уровнях организации – от субклеточных структур и мембранных образований до организма в целом [Hensley K. et al., 2004], существенно не повлиял на поведение крыс OXYS в тесте «открытое поле» и приподнятом крестообразном лабиринте. Принципиально важно, что оба и экстракт черники, и, особенно витамин Е, значительно увеличили тревожность молодых крыс Вистар, не изменив их двигательную активность.

Одним из универсальных проявлений старения становятся изменения в митохондриях, которые, в то же время, являются основным источником АФК. Свойственные и нормальному старению структурно-функциональные изменения митохондрий, снижение их энергетического потенциала, активация апоптоза и усиление генерации АФК, лежат в основе патогенеза заболеваний пожилого возраста, в том числе – нейродегенеративных. Одной из наиболее вероятных причин преждевременного старения крыс OXYS также могут быть нарушения структуры и функций митохондрий, которые появляются у них уже в возрасте 3-4 мес. и с возрастом нарастают. У крыс OXYS выявлены изменение соотношения цитохромов внутренней мембраны митохондрий, снижение активности F₁F₀-ATФсинтетазы, дыхательного контроля и скорости фосфорилирования, снижение объёмной и поверхностной плотности митохондрий, появление митохондрий с лизисом матрикса и деструкцией крист [Шабалина и др., 1995; Колосова Н.Г. и др., 2001; Бакарев М.А., Непомнящих Л.М., 2004]. Такие поврежденные митохондрии не могут выполнять свои функции, становятся источником повышенного образования АФК и самоликвидируются по механизму, который был назван В.П. Скулачевым «митоптозом» [Скулачев В., 1999]. В физиологических условиях это позволяет митохондриальной популяции очищаться от митохондрий, продуцирующих избыточные количества АФК и сохранять жизнь клетке. Когда усиленная генерация АФК и связанное с ней открытие неспецифической поры происходят в большинстве митохондрий клетки, в результате набухания митохондриального матрикса, разрушения внешней митохондриальной мембраны, выхода цитохрома с и других проапоптозных агентов из межмембранного пространства в цитозоль неизбежно запускается апоптоз [Skulachev V.et al., 2004].

Ранее сообщалось, что эффективность антиоксидантов в профилактике преждевременного старения крыс OXYS (способность предотвращать развитие катаракты) тесно связана с их способностью предупреждать или задерживать развитие структурно-функциональных нарушений митохондрий (Шабалина И.Г., 2001.). Возможность направленных терапевтических воздействий непосредственно на митохондрии – давняя мечта фармакологов, работающих над созданием геропротекторов. Как отмечалось выше, перспектива стать таким инструментом есть у митохондриальных антиоксидантов, способных избирательно накапливаться в митохондриях. Их эффективность на момент постановки задач настоящей работы исследовалась только на клеточных системах.

В нашей работе впервые исследовано влияние на поведение соединений принципиально нового класса – антиоксидантов, способных проникать и накапливаться в митохондриях: убихинон-децил-трифенилфосфония [МitoQ, Murphy M.P., 2001] и пластохинонил-децил-трифенилфосфония [SkQ1, Скулачев В.П., 2007]. Показано, что эффект профилактического приёма MitoQ (250 нмоль/кг веса с кормом с возраста 1,5 мес. в течение 45 дней) оказался аналогичным эффекту экстракта черники. MitoQ предупредил развитие характерных для крыс OXYS поведенческих признаков в критический период их развития, но увеличил тревожность крыс Вистар. Можно полагать, что влияние MitoQ связано с его способностью накапливаться и восстанавливаться в митохондриях, защищая их от окислительного стресса в критический момент манифестации фенотипических проявлений преждевременного старения у крыс OXYS. В то же время влияние MitoQ на поведенческий стереотип здорового организма также оказалось неоднозначным.

Как отмечалось выше, уникальными антиоксидантными свойствами обладает другой митохондриальный антиоксидант - SkQ1. Известно, что антиоксиданты в высоких концентрациях могут выступать как прооксиданты. SkQ1 отличает широкий «коридор» концентраций, в котором он проявляет только свойства антиоксиданта, причем в очень низких концентрациях (Antonenko V. et al., 2008; Скулачев В.П., 2007). Мы показали (Нероев и др., 2008), что SkQ1 способен не только предупреждать развитие катаракты и ретинопатии у крыс OXYS, но снижает выраженность уже развитых патологических изменений сетчатки и хрусталиков, что было подтверждено и в настоящем исследовании. В то же время профилактический приём SkQ1 (50 нмоль/кг веса в течение 45 дней), начатый в возрасте 1,5 мес., значительно повысил тревожность не только крыс Вистар, но и OXYS, и также, как MitoQ и витамин Е, не повлиял на их двигательную активность.

Как было показано нами в рамках комплексного исследования (Нероев и др., 2008), приём SkQ1 в дозах 50 и 250 нмоль/кг массы тела c возраста 1,5 мес. сохранил заболеваемость катарактой и ретинопатией у двухгодовалых крыс OXYS на уровне полуторамесячных животных, а в дозе 10 нмоль/кг существенно снизил её. Именно на этих животных было выполнено исследование влияния длительного приёма SkQ1 на поведение. На момент исследования крысы достигли возраста 12 мес.

Как показали наши исследования, SkQ1 способен влиять на возрастные изменения поведения, но его эффекты зависят от генотипа животных и дозы антиоксиданта. Во всех испытанных дозах (10, 50 или 250 нмоль/кг) SkQ1 предупредил снижение двигательной и исследовательской активности у крыс Вистар, не изменив их тревожность. У крыс OXYS антиоксидант дозозависимо повысил тревожность и не влиял на их моторно-исследовательскую активность, но при этом SkQ1 (250 нмоль/кг) предупредил снижение способности к обучению крыс OXYS в лабиринте Морриса. У годовалых крыс Вистар способность к обучению сохранялась на уровне трёхмесячных животных, и антиоксидант не влиял на неё.

Примечательно, что в этом же эксперименте нами был выявлено позитивное влияние SkQ1 на половое поведение самцов [Amstislavskaya T.G., Stefanova N.A., et al., 2010]. SkQ1 не изменил мотивационную составляющую полового поведения самцов крыс Вистар, сохранившуюся на уровне трёхмесячных животных. У самцов крыс OXYS, которых отличает раннее снижение половой мотивации, в дозах 50 или 250 нмоль/кг антиоксидант предупредил её снижение до уровня, не отличающегося от показателей крыс Вистар. Полученные данные свидетельствуют о существенном вкладе роли окислительного стресса в снижение полового мотивационного поведения крыс OXYS.

Иначе подействовал SkQ1 на годовалых крыс обеих линий с уже выраженными возрастными изменениями поведения (250 нмоль/кг в сутки в течение 2-3 мес.). SkQ1 повысил двигательную и исследовательскую активность крыс обеих линий в тесте «открытое поле» и существенно снизил их тревожность в приподнятом крестообразном лабиринте. В поведение 14-месячных крыс Вистар и OXYS, принимавших SkQ1, было таким, как в возрасте 3 месяцев.

Несмотря на увеличение моторно-исследовательской активности и снижение тревожности до уровня молодых животных у крыс обеих линий, SkQ1 по-разному повлиял на их способность к обучению. Антиоксидант не повлиял на способность к обучению крыс OXYS, у которых пространственная память в возрасте 14,5 мес. была ниже, чем у крыс Вистар. Такая ситуация могла быть следствием прогрессирующим развитием катаракты и ретинопатии. Однако результаты офтальмологического осмотра продемонстрировали существенное снижение выраженности патологических проявлений катаракты и ретинопатии у принимавших SkQ1 крыс OXYS, что предполагает улучшение зрительной функции. Кроме того, проведенный нами корелляционный анализ не выявил связи между выраженностью патологических изменений сетчатки и хрусталиков и латентным периодом нахождения невидимой платформы крысами OXYS. Как контрольные, так и принимавшие SkQ1 крысы OXYS в результате обучались в водном лабиринте Морриса, а их сниженная способность к пространственной памяти в первые дни обучения, по сравнению с крысами Вистар, подтверждает нарушения их краткосрочной памяти и не может быть связана только с состоянием их зрения. Аналогичные результаты были получены на крысах линии RCS (Royal College of Surgeons) с наследственной дистрофией сетчатки, способность которых к обучению в водном лабиринте Морриса крыс сохранялась при существенных поражениях фоторецепторного слоя сетчатки и не зависела от их зрительной функции [DiLoreto D.A. et al., 1998.].

Большей неожиданностью для нас оказались результаты, полученные на крысах Вистар. Антиоксидант значимо снизил способность к обучению крыс Вистар, что проявилось в увеличении латентного периода нахождения невидимой платформы в водном лабиринте Морриса в каждый из дней тестирования. Francia и соавторы [2006] связывают способность к обучению в водном лабиринте Морриса мышей среднего возраста со снижением исследовательского поведения. Однако наши результаты противоречат этим выводам. В другой работе авторы предполагают, что снижение способности к обучению в водном лабиринте Морриса связаны со снижением исследовательской активности на платформе в лабиринте [Schulz D., Kouri C., Huston J.P. 2007]. Наши результаты согласуются с данными Miyagawa и соавторов, которые на 28-месячных крысах-самцах линии Вистар показали, что возрастное снижением способности к обучению и памяти у крыс прямо не связаны с изменениями моторного поведения. Разделенные на две группы по способности к обучению в водном лабиринте Морриса (с нарушениями памяти и без нарушений), животные не различались по локомоторному и эмоциональному поведению в тесте «открытое поле» и приподнятом крестообразном лабиринте [Miyagawa H et al., 1998].

Известно, что на процессы обучения и памяти влияют эмоциональное состояние, в том числе – тревожность. Её повышенный или низкий уровень может тормозить внимание и снижать эффективность запоминания. Вероятно, выявленное у крыс Вистар снижение способности к обучению в лабиринте Морриса, связано с критическим снижением уровня их тревожности. Наши результаты согласуются с данными [Holmes A. et al., 2002], которые показали на мышах различных линий, что животные с пониженным уровнем тревожности демонстрировали сниженную способность к пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. Вполне возможно, что эффект SkQ1 на способность к обучению у крыс Вистар в водном лабиринте Морриса связан с критическим снижением их тревожности, которое может ослаблять внимание и, как следствие, обучаемость [Дубровина Н.И., Савостьянова Д.А., 2003; Кравченко Е.В., Синкевич Н.М., 2008].

 

Таким образом, эффекты антиоксидантов зависят от генотипа животных, их возраста, длительности применения, дозы и специфики самого антиоксиданта. В целом полученные результаты указывают на способность антиоксидантов неоднозначно влиять на здоровый организм в молодом возрасте и необходимость дальнейшего изучения вопроса об оптимальных способах их использования в качестве геропротекторов. Как показали результаты настоящего исследования, линия крыс OXYS - адекватная модель ускоренного старения мозга и может использоваться для исследования его механизмов и оценки эффективности терапевтических воздействий как антиоксидантов, так и геропротекторов другой природы.

ВЫВОДЫ

1. У крыс OXYS, как и у крыс Вистар, с возрастом двигательная и исследовательская активность снижается, а тревожность растет, но ускоренными темпами. Повышенный уровень тревожности, сниженная двигательная и исследовательская активность развиваются у крыс OXYS к возрасту 3 мес., нарушения пространственной памяти – к 12-14 мес. Они не являются врожденными и развиваются параллельно с нейродегенеративными изменениями мозга, выявленными методами МРТ.

2. На поведение крыс OXYS влияет развитие катаракты и ретинопатии: в возрасте 3 мес. поисково-исследовательская активность прямо, а тревожность – отрицательно зависят от выраженности патологических изменений хрусталиков и сетчатки; в 12 мес. и старше их выраженность, напротив, отрицательно коррелирует с активностью и положительно – с тревожностью животных.

3. Все исследованные антиоксиданты: витамин Е, флавоноиды черники, адресованные в митохондрии антиоксиданты MitoQ и SkQ1, - влияют на уровень тревожности и на поисково-исследовательскую активность животных.

4. Профилактический приём SkQ1 (с 1,5 до 12 мес.) замедлил снижение способности к обучению и повысил тревожность крыс OXYS. Не изменив тревожность, SkQ1 предупредил снижение поисково-исследовательской активности у крыс Вистар.

5. SkQ1 повысил поисково-исследовательскую активность и снизил тревожность до уровня молодых у крыс Вистар и OXYS с уже выраженными возрастными изменениями этих параметров.

6. Эффекты антиоксидантов зависят от генотипа, возраста животных, дозы и длительности их приёма.

7. Линия крыс OXYS является адекватной моделью для исследования механизмов старения мозга и оценки эффективности терапевтических воздействий.

Список литературы

 

1. Агапова Л.С., Черняк Б.В., Домнина Л.В., Дугина В.Б., Ефименко А.Ю., Фетисова Е.К., Иванова О.Ю., Калинина Н.И., Хромова Н.В., Копнин, Б.П., Копнин П.Б., Коротецкая, М.В., Личенницер М.Р., Лукашев А.Н., Плетюшкина, О.Ю., Попова Е.Н., Скулачев М.В., Шагиева Г.С., Степанова Е.В., Титова Е.В., Ткачук В.А., Васильев Ю.М., Скулачев В.П. 2008. Биохимия. 73:1622–1640.

2. Анисимов В. Н.2003. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: Наука 1:672.

3. Анисимов В. Н. 2008. Молекулярные и физиологические механизмы старения в 2 т., Т. 2-е изд., перераб. и доп. СПб.: Наука 1:481.

4. Антоненко Ю.Н., Аветисян А.В., Бакеева Л.Е., Черняк Б.В., Чертков В.А., Домнина Л.В., Иванова О.Ю., Изюмов Д.С., Хайлова Л.С., Клишин С.С., Коршунов С.С., Коршунова Г.А., Лямзаев К.Г., Мунтян М.С., Непряхина О.К., Пашковская А.А., Плетюшкина О.Ю., Пустовидко А.В., Рогинский В.А., Рокитская Т.И., Рууге, Э.К., Сапрунова, В.Б., Северина И.И.,Симонян Р.А., Скулачев И.В., Скулачев М.В., Сумбатян Н.В., Свиряева И.В., Ташлицкий В.Н., Васильев Ю.М., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С., Замятнин А.А.(мл), Скулачев В.П. 2008. Биохимия. 73:1589–1606.

5. Бакарев М.А., Непомнящих Л.М. 2004. Структурные проявления нарушений митохондриальной функции в скелетных мышцах у преждевременно старею

⇐ Предыдущая1234

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: