 |
Глава 3. Результаты исследования
|
|
|
|
3.1. Изменения поведения крыс OXYS и Вистар с возрастом
На первом этапе исследования мы провели сравнение поведения крыс Вистар и OXYS в возрасте 1, 3, 12, 16 и 24 мес. Было установлено, что только в возрасте до 12 месяцев поведение крыс OXYS не зависит от свойственных им нарушений зрительной функции. Анализу зависимости поведения крыс OXYS от выраженности патологических изменений хрусталиков и сетчатки посвящен специальный раздел. Исследование ранних изменений поведения как возможного проявления преждевременного старения мозга крыс OXYS выполнено на животных в возрасте 1, 3 и 12 мес.
3.1.1. Тест «открытое поле»
Согласно результатам факторного ANOVA анализа, в тесте «открытое поле» поведение крыс обеих линий с возрастом менялось: с его увеличением уменьшалось количество пересеченных квадратов (F2,152=53, p<0,00) и вертикальных стоек (F2,152=13, p<0,00), указывая на снижение двигательной и исследовательской активности (табл. 1). Генотип влиял на горизонтальную и вертикальную активность животных (F1,152=56, p<0,00 и F1,152=20, p<0,00, соответственно), которая была меньше у крыс OXYS. Факторы «возраст» и «генотип» взаимодействовали, что было обусловлено межлинейными различиями возрастных изменений горизонтальной (F2,152=12, p<0,00) и вертикальной (F2,152=4, p<0,01) активности. Так, к возрасту 3 мес. горизонтальная активность у крыс OXYS становилась на 77% меньше, чем у месячных (p<0,05), в то время как у крыс Вистар за этот период она не менялась и только к 12 мес. снижалась вдвое (p<0,05). В результате, если в возрасте 1 мес. межлинейные различия отсутствовали, то в 3 и 12 мес. этот показатель у крыс OXYS был на 75% и 66%, меньше, чем у крыс Вистар, что указывает на более высокий темп снижения двигательной активности крыс OXYS с возрастом. Вертикальная активность у крыс OXYS в возрасте 3 и 12 мес. была на 68% ниже, чем в 1 мес. (p<0,05), у крыс Вистар с возрастом достоверно не менялась, поэтому исследовательская активность крыс OXYS уже в возрасте 3 мес. была снижена по сравнению с крысами Вистар.
|
|
|
Таблица 1
Показатели возрастных изменений поведения
крыс OXYS и Вистар в тесте «открытое поле»
| Возраст (мес.) | Вистар | OXYS | ||||
| 1 (n=20) | 3 (n=30) | 12 (n=26) | 1 (n=20) | 3 (n=30) | 12 (n=26) | |
| Латентный период выхода в центр, сек. | 201±21,4 | 228±14,9 | 241±16,6 | 259±15,8# | 291±6,6# | 268±13,7 |
| Пересеченные квадраты, n | 133±14,5 | 108±8,9 | 60±5,2^* | 117±12,4 | 27±3,05#* | 20±3,4#^ |
| Вертикальные стойки, n | 11,2±1,4 | 11,3±0,9 | 8,6±0,7 | 10,9±1,6 | 3,5±0,4# * | 3,5±0,5# ^ |
| Дефекации, n | 2,2±0,3 | 2,3±0,3 | 2,3±0,2 | 3,4±0,5 | 2,4±0,3 | 3,1±0,4 |
| Груминг, n | 2,9±0,4 | 3,4±0,3 | 4,3±0,3^ | 3,4±0,5 | 3,9±0,5 | 3,6±0,3 |
Примечание: * - p<0,05 по сравнению с предыдущим возрастом, ^ - p<0,05 по сравнению с 1 мес. крысами одной линии, # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар одного возраста.
Показатели тревожности в тесте «открытое поле»: латентный период выхода в центр и количество дефекаций – зависели только от генотипа животных и были больше у крыс OXYS (F1,152=14, p<0,00 и F2,152=5, p<0,02, соответственно).
Количество груминговых реакций – показатель неспецифического поведения животных в установке. С одной стороны, его традиционно рассматривают как показатель уровня тревожности или стресса. С другой стороны, он может становиться, в зависимости от характера, и показателем комфортного поведения [Aguilar R. et al., 2002; Kalueff A.V., Tuohimaa P., 2004]. Количество груминговых реакций не зависело ни от генотипа, ни от возраста (p>0,05).
Роль груминга в поведении животных в условиях эмоционального стресса, реакции на новизну или тревожности до сих пор крайне неясна. Однако, несмотря на отнесение груминга к довольно «безликому» неспецифическому поведению, он представляет собой, достаточно автономный поведенческий показатель, который может быть специфически активирован в определенных условиях опытов, иногда на фоне отсутствия каких-либо других поведенческих эффектов.
|
|
|
3.1.2. Приподнятый крестообразный лабиринт
В приподнятом крестообразном лабиринте активность крыс OXYS и Вистар с возрастом также снижалась, что проявилось в уменьшении количества выходов в центр (F2,158=7, p<0,00), переходов в закрытые рукава (F2,158=7, p<0,00) и вертикальных стоек (F2,158=5, p<0,005) (табл. 1). Уровень тревожности, напротив, увеличивался, на что указывало снижение количества выходов в открытые рукава (F2,158=19, p<0,00), время, проведенное в них (F2,158=15, p<0,00) и в центре приподнятого крестообразного лабиринта (F2,158=3, p<0,028). В возрасте 12 мес. крысы OXYS проводили на 81% (p<0,01), а Вистар - на 91% (p<0,0001) меньше времени в открытых рукавах, чем в возрасте 3 мес., а время, проведенное в закрытых рукавах, росло (F2,158=16, p<0,00). С возрастом увеличивалось и количество дефекаций (F2,158=8, p<0,00).
Таблица 2
Показатели возрастных изменений поведения
крыс OXYS и Вистар в приподнятом крестообразном лабиринте
| Возраст, мес. | Вистар | OXYS | ||||
| 1 (n=20) | 3 (n=30) | 12 (n=30) | 1 (n=20) | 3 (n=30) | 12 (n=28) | |
| Латентный период начала движения, сек. | 0,4±0,2 | 0,1±0,1 | 0,0±0 | 0,3±0,2 | 1,4±0,8 | 1,1±0,9 |
| Выходы в центр, n | 1,4±0,3 | 1,3±0,1 | 0,6±0,2 | 1,3±0,3 | 0,6±0,1#* | 0,3±0,2^ |
| Время в центре, сек. | 10,8±2,2 | 13,3±2,2 | 6,7±1,8* | 9,4±2,2 | 8,0±1,8 | 3,5±2,3 |
| Переходы в закрытые рукава, n | 3,4±0,6 | 3,1±0,2 | 1,6±0,3^* | 2,2±0,4 | 1,3±0,2#* | 0,8±0,2^ |
| Выходы в открытые рукава, n | 2,6±0,5 | 2,5±0,2 | 0,3±0,1* | 2,1±0,4 | 1,3±0,3# | 0,3±0,1* |
| Время в закрытых рукавах, сек. | 237±11 | 219±7 | 287±4^* | 213±16 | 238±12 | 285±6^* |
| Время в открытых рукавах, сек. | 51±9,7 | 67±5,6 | 6±2,4^* | 77±14,7 | 52±11,9 | 10±3,9^* |
| Вертикальные стойки, n | 12,6±0,9 | 10,9±0,5 | 11,0±0,6 | 7,4±0,6# | 7,3±0,5# | 4,4±0,5#^* |
| Выглядывания, n | 3,3±0,5 | 4,2±0,4 | 5,3±0,6^ | 2,4±0,4 | 1,6±0,3# | 2,0±0,4# |
| Дефекации, n | 1,6±0,3 | 2,3±0,4 | 1,9±0,3 | 1,4±0,3 | 3,4±0,4* | 1,2±0,4* |
| Груминг, n | 4,6±0,5 | 4,6±0,4 | 4,5±0,3 | 4,6±0,5 | 3,5±0,4 | 3,9±0,3 |
Примечание: * - p<0,05 по сравнению с предыдущим возрастом, ^ - p<0,05 по сравнению с 1 мес. крысами одной линии, # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар одного возраста.
Генотип влиял на количество выходов в центр приподнятого крестообразного лабиринта (F1,158=4,2, p<0,04), переходов в закрытые (F1,158=14, p<0,00) и открытые рукава (F1,158=4, p<0,04), вертикальных стоек (F1,158=85, p<0,00) и выглядываний (F1,158=39, p<0,000). Все эти показатели были выше у крыс Вистар, что свидетельствует о более высоком уровне тревожности и сниженной двигательной активности крыс OXYS. Количество переходов в закрытые рукава у крыс Вистар снижалось к 12 мес. (p<0,05), тогда как у крыс OXYS этот показатель в возрасте 3 мес. был меньше, чем у месячных крыс этой линии (p<0,04) и у трёхмесячных крыс Вистар (p<0,00). Количество вертикальных стоек у крыс OXYS было меньше, чем у крыс Вистар во все возрастные периоды (p<0,05), что указывает на их сниженный уровень исследовательской активности. С возрастом снижение показателя было достоверным только у крыс OXYS: в возрасте 12 мес. он был меньше, чем в 1 и 3 мес. (p<0,05). Количество груминговых реакций с возрастом значимо не менялось у крыс обеих линий, а количество дефекаций изменилось только у крыс OXYS: выросло к возрасту 3 мес. и вновь снизилось к 12 мес.
|
|
|
3.1.3. Водный лабиринт Морриса
Исследование пространственной памяти в водном лабиринте Морриса крыс Вистар и OXYS в водном лабиринте Морриса выполнено на животных в возрасте 3, 12 и 16 месяцев. Как показал анализ результатов, у крыс Вистар способность к обучению в возрасте 3, 12 и 16 мес. достоверно не различалась (рис.1а), в то время как у крыс OXYS снижалась с возрастом (p<0,05), что отражает постепенное ухудшение когнитивных функций мозга (рис. 1б). Однако только в возрасте 16 мес. крысы OXYS обучались достоверно хуже, чем крысы Вистар. При этом только в первые три дня на нахождение невидимой платформы крысы OXYS затрачивали больше времени (p<0,05), чем крысы Вистар, а на 4-й и 5-й день обучения они уже от них не отличались по латентному периоду нахождения платформы. Значительные нарушения временной организации обучения и памяти крыс OXYS в водном лабиринте Морриса, по-видимому, наступают только в этом возрасте. В то же время способность к обучению условной реакции пассивного избегания при её однократном предъявлении - снижена у крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар уже в возрасте 3 мес. [Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г., 2000]. Возможно, что, как и у стареющих людей, у крыс OXYS страдает, прежде всего, краткосрочная память в условиях однократного предъявления стимула. С другой стороны, различия могут быть связаны с не одинаковой «жесткостью» тестов, поскольку, известно, что на процессы обучения и памяти влияют эмоциональный фон и тревожность.
|
|
|
Рис. 1. Изменение с возрастом латентного периода нахождения невидимой платформы у крыс Вистар (а) и OXYS (б). *- p<0,05 по сравнению с 3-х мес. крысами одной линии, # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар одного возраста.
Таким образом, с возрастом моторно-исследовательская активность снижается, а уровень тревожности растет у крыс обеих линий, что согласуется с данными ряда исследователей, согласно которым у грызунов при старении увеличивается тревожность, а двигательная активность снижается [Torras-Garcia M. et al., 2005; Chen G.H. et al., 2007; Schulz D. et al., 2007]. Различия между крысами OXYS и Вистар появились к возрасту 3 мес., а к возрасту 12 мес. усилились. Как известно, в патогенезе нейродегенеративных процессов ключевую роль играют окислительный стресс и ишемия. Ранее у крыс OXYS в возрасте 2 мес. был выявлен повышенный уровень маркёров окислительного стресса – окисленных липидов в структурах мозга, связанных с обучением и памятью [Колосова Н.Г. и др., 2002]. Согласно исследованиям энергетического метаболизма, в мозге 20-дневных крыс OXYS присутствуют признаки адаптации к гипоксии [Sergeeva S.V. et al., 2006], а по данным МРТ в 12 мес. – характерные для хронической ишемии нарушения церебрального кровотока [Агафонова И.В. и др., 2007]. Следствием таких изменений могли быть нейродегенеративные изменения мозга, которые и были нами исследованы методами МРТ.
3.2. Поведение крыс OXYS и развитие катаракты и ретинопатии
Поскольку изменения поведения у крыс OXYS развиваются параллельно с катарактой и ретинопатией, закономерно было предположить, что ускоренное снижение с возрастом моторного и исследовательского поведения, способности к обучению в водном лабиринте Морриса связаны с нарушениями зрительной функции. Ранее установлено, что первые клинические признаки катаракты и ретинопатии у 20% крыс OXYS появляются к возрасту 1,5 мес., а в 3-4 мес. присутствуют практически у всех животных. Затем они прогрессируют, достигая стадий, предполагающих полную потерю зрения, к возрасту 18-24 мес. [Колосова Н.Г. и др., 2003; Румянцева Ю.А. и др., 2008; Жданкина О. и др., 2008].
Возможную связь изменений поведения крыс OXYS с нарушением зрения мы исследовали на крысах в возрасте 3 и 12 мес. С этой целью был проведен корреляционный анализ (использовали ранговые корреляции Спирмена). У трехмесячных крыс OXYS отсутствовала связь между выраженностью патологических изменений хрусталиков и сетчатки и параметрами поведения в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт». К возрасту 12 мес. у крыс OXYS катаракта и ретинопатия активно прогрессируют. В этом возрасте появлялась отрицательная связь между выраженностью патологических изменений сетчатки и хрусталиков и поведением: с вертикальной (r=-0,4 и r=-0,5, p<0,05, соответственно) и горизонтальной активностью (r=-0,3 и r=-0,4, p<0,05, соответственно) в тесте «открытое поле», с количеством выходов в открытые рукава приподнятого крестообразного лабиринта (r=-0,6 и r=-0,6, p<0,05, соответственно) и временем, проведенном в них (r=-0,5 и r=-0,4, p<0,05, соответственно). Аналогичные результаты были получены при анализе поведения двухгодовалых крыс OXYS.
|
|
|
Таким образом, изменения зрительной функции оказывают определенное влияние на поведение старых крыс OXYS в тесте «открытое поле» и приподнятом крестообразном лабиринте. Крысы с более выраженными стадиями катаракты и ретинопатии, предполагающими снижение зрительной функции, демонстрировали более пассивный характер поведения. В то же время мы не выявили связи между состоянием сетчатки и хрусталиков крыс OXYS и их пространственной ориентацией в водном лабиринте Морриса. По-видимому, это обусловлено тем, что она определяется не только остротой зрения и использованием внешних ориентиров, но и счислением пути, запоминанием собственного положения в пространстве [DiLoreto D.A. et al., 1998]. Это позволяет заключить, что снижение способности к обучению крыс OXYS в 12-16 мес. также связано, прежде всего, с нейродегенеративными изменениями мозга.
3.3. Магнитно-резонансная томография мозга
МРТ исследование выполнено на крысах в возрасте 3, 6, 12 и 24 мес. Его результаты показали, что в возрасте 3 мес. объем головного мозга у крыс OXYS меньше, чем у крыс Вистар (2461±37 и 2569±20 мм3, соответственно), что закономерно обусловлено меньшей массой тела крыс OXYS. К возрасту 12 мес. объем головного мозга у крыс Вистар увеличился на 4% (p<0,0001), в то время как у крыс OXYS снизился также на 4% (p<0,0001). Межлинейных различий в размерах передних отделов гиппокампа и полости рогов желудочков головного мозга у 3-месячных животных не выявлено (табл. 3). Объем ликвора субарахноидальных пространств у крыс OXYS в этом возрасте был на 20% меньше, чем у крыс Вистар (p<0,000). В то же время на рис.2 видно, что уже в возрасте 3 мес. у крыс OXYS выявляются признаки гидроцефалии боковых желудочков головного мозга. У крыс Вистар объем ликвора субарахноидальных пространств к возрасту 12 мес. не изменился, а у крыс OXYS он увеличился на 12,3% за счёт расширения наружного субарахноидального пространства долей, обусловленного корковой атрофией (рис.4).
Таблица 3
Изменения морфологических показателей головного мозга крыс OXYS и Вистар с возрастом. Данные магнитно-резонансной томографии представлены как M±SD, n=9
| Возраст | 3 мес. | 12 мес. | ||
| Линия | OXYS | Вистар | OXYS | Вистар |
| Полости рогов желудочков, мм3 | 140±10,4 | 133±6,2 | 120±8,4* | 135±7,3# |
| Ликвор субарахноидальных пространств ГМ, мм3 | 105±6,2# | 132±6,4 | 118±6,0* | 135±9,4* |
| Передние отделы гиппокампа, мм3 | 133±6,4# | 149±10,0 | 135±9,4# | 131±8,3* |
| Интенсивность сигнала от проекции гиппокампа в Т2-ВИ, отн. ед. | 102±3,4# | 86±2,2 | 135±3,3* | 86±1,5# |
| Интенсивность сигнала от срединных структур мозга, в Т2-ВИ, отн. ед. | 105±1,6 | 92±6,1 | 143±3,3* | 92±1,4# |
| Количество очагов демиелинизации, n | 0,75±0,17 | 0±0 | 1,36±0,12 | 0,33±0,23 |
Примечание: * – значимые изменения с возрастом, # – достоверные межлинейные отличия.
а
| 
б
|
Рис. 2. 1. МРТ на Т2-ВИ структур головного мозга крыс OXYS (а) и Вистар (б) в возрасте 3-х месяцев. Стрелкой указана гидроцефалия боковых желудочков у трехмесячных OXYS.
На рис. 3 отчетливо визуализируется развитие наружной и внутренней гидроцефалии, формирование периваскулярной атрофии белого вещества мозга. Как известно, избыточное скопление ликвора вызывает повышение его давления на вещество головного мозга и может приводить к развитию внутричерепной гипертензии.
С возрастом очаги демиелинизации появились и у крыс Вистар, но в 12 и 24 мес. количество очагов было в 4 и 6 раз меньше, чем у OXYS (p<0,001). У крыс OXYS всех возрастных групп увеличена удельная площадь боковых желудочков мозга (для всех p<0,01), отражающая их объем, увеличение которого могло быть связано с дисбалансом между выработкой ликвора и его резорбцией, характерным для нейродегенеративных состояний.
У годовалых крыс OXYS на Т2-ВИ выявлялись очаги гиперинтенсивных, а на Т1-ВИ и FLAIR гипоинтенсивных МР сигналов. Такие изменения ассоциируются с признаками прогрессирующей демиелинизации. Сигнальные характеристики аналогичны таковым ликвора: высокие в режиме Т2-ВИ и низкие в режиме Т1-ВИ. Демиелинизация на томограмме в режиме Т2-ВИ представляет собой гиперинтенсивные зоны разной формы и локализации (Рис.4).
а
| 
б
|
Рис. 4. МРТ на Т2-ВИ структур головного мозга 12-месячной крысы OXYS (а) и Вистар (б). Стрелками обозначены очаги демиелинизации.
Очаговые изменения выявлялись в основном в перивентрикулярных отделах. Такие изменения белого вещества, особенно около передних рогов боковых желудочков, являются вторичными, возможно, они возникли вследствие изменения ликвородинамики в мозге. В зоне смежного кровоснабжения у годовалых крыс OXYS обнаружены признаки перивентрикулярного лейкоареоза и патоморфологические нарушения, о чём свидетельствует увеличение в 1,4 раза, по сравнению с 3-месячными животными, интенсивности сигнала от срединных структур мозга (табл. 3.).
Таким образом, данные МРТ исследований показали, что у крыс OXYS начиная с возраста 3 мес. присутствуют очаги демиелинизации - разрушения или нарушения формирования миелиновой оболочки нервных волокон, характерные для нейродегенеративных процессов. С их появлением совпадает по времени формирование пассивного поведенческого стереотипа у крыс OXYS, в то время как снижение способности к обучению в водном лабиринте Морриса проявляется позже на фоне прогрессирующих нейродегенеративных изменений и хронической ишемии. Очаговые изменения выявлялись в основном в перивентрикулярных отделах. Такие изменения белого вещества, особенно около передних рогов боковых желудочков, являются вторичными, возможно, они возникли вследствие изменения ликвородинамики в головном мозге. В целом полученные результаты свидетельствуют о том, что формирование характерных для крыс OXYS особенностей поведения связано с развитием нейродегенеративных изменений и является проявлением преждевременного старения их мозга.
3.4. Влияние антиоксидантов на поведение крыс OXYS и Вистар
3.4.1. Влияние антиоксидантов на поведение
молодых крыс OXYS и Вистар
Способность антиоксидантов предупреждать развитие характерных для крыс OXYS поведенческих признаков оценивали в критический период их развития в 3 сериях экспериментов: в 1-ой - витамина Е и флавоноидов черники, во 2-ой - SkQ1 и витамина Е, в 3-ей - MitoQ. Антиоксиданты животные получали с кормом, как описано в разделе 2.1.4. В каждой из серий экспериментов межлинейные различия были отчетливо выражены: двигательная и исследовательская активность у контрольных крыс OXYS была ниже, а тревожность выше, чем у крыс Вистар (p<0,05).
Тест «открытое поле». В 1-ой серииэкспериментов экстракт черники увеличил горизонтальную активность крыс OXYS на 55% (p<0,03), эффект витамина Е был выражен на уровне тенденции (рис. 5а). Оба антиоксиданта значимо не меняли вертикальную активность животных. На количество дефекаций повлиял только витамин Е (рис. 5б). Он увеличил его у крыс Вистар более, чем втрое (p<0,02), а латентный период выхода в центр - до 5 мин., значения, соответствующего периоду наблюдений (р<0,07), что свидетельствует о повышении под влиянием витамина Е тревожности этих животных.
Рис. 5. Влияние 45-дневного приема экстракта черники (20мг/кг) и витамина Е (40мг/кг) с возраста 1,5 мес. на количество пересеченных квадратов (а) и дефекаций (б) крыс Вистар и OXYS в тесте «открытое поле» (n=15).
# - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар, * - эффект препарата (p<0,05).
Во 2-ой серии оценивали эффекты митохондриального антиоксиданта MitoQ. Его приём увеличил горизонтальную активность крыс OXYS на 74% (p<0,004), вертикальную - на 117% (p<0,02), но при этом снизил эти показатели у крыс Вистар на 29% и 32%, соответственно (p>0,05) (рис. 6а, б). Таким образом, MitoQ предупредил характерное для этого возраста снижение моторно-исследовательского поведения у крыс OXYS, но при этом снизил активность крыс Вистар, а также повысил их тревожность: количество дефекаций увеличилось у них на 144% (p<0,02).
Рис. 6. Влияние 45-дневного приема MitoQ (250 нмоль/кг) с возраста 1,5 мес. на количество пересеченных квадратов (а) и вертикальных стоек (б) крыс Вистар и OXYS в тесте «открытое поле». # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар, * - эффект препарата (p<0,05).
В 3-ей серии мы проводили сравнение эффектов витамина Е и митохондриального антиоксиданта SkQ1. Как и в 1-ой серии, витамин Е снизил горизонтальную активность крыс Вистар на 56% (р<0,00) (рис. 7а) и привел к росту тревожности – увеличил латентный период выхода в центр «открытого поля» на 70% (р<0,04). Вертикальную активность изменил только SkQ1 и только у крыс OXYS: снизил ее на 29% (р<0,04) (рис. 7б). Оба антиоксиданта увеличили количество груминговых реакций у животных обеих линий: у крыс Вистар SkQ1 повысил её достоверно - на 40% (р<0,04), витамин Е на 34 % - на уровне тенденции. У крыс OXYS значимым и ярко выраженным оказался эффект витамина Е, который увеличил количество грумингов на 143% (р<0,02).
В условиях снижения моторно-исследовательского поведения и роста уровня тревожности крыс Вистар, увеличение числа груминговых реакций, согласно традиционным воззрениям, рассматривается как показатель стресса, тогда как у крыс OXYS существенное увеличение показателя вызвано, по-видимому, противоположным эффектом антиоксиданта и может быть по своему характеру и с учетом контекста отнесено к компоненту «комфортного» поведения. В пользу такой трактовки свидетельствует характер влияния витамина Е и SkQ1 на такой показатель тревожности как количество дефекаций, на который антиоксиданты у крыс Вистар и OXYS повлияли противоположным образом: снизили его, а, следовательно, и тревожность, у крыс OXYS и повысили - у крыс Вистар (на 375 и 300%, соответственно, р<0,05).
Рис. 7. Влияние 45-дневного приема SkQ1 (50 нмоль/кг) и витамина Е (20 мг/кг) с возраста 1,5 мес. на количество пересеченных квадратов (а) и вертикальных стоек (б) крыс Вистар и OXYS в тесте «открытое поле». # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар, * - эффект препарата (p<0,05).
Тест приподнятый крестообразный лабиринт. В 1-ой серии экстракт черники увеличил количество выходов в открытые рукава и время пребывания в них у крыс OXYS (р<0,04) до уровня контрольных крыс Вистар, снизив, таким образом, их тревожность (рис.8а,б). Витамин Е не влиял на тревожность крыс OXYS, но существенно повысил её у Вистар: уменьшил количество выходов в открытые рукава и время пребывания в них в 14,5 раз (р<0,02). В том же направлении влиял и экстракт черники, но на уровне тенденции (р<0,07).
Рис. 8. Влияние 45-дневного приема экстракта черники (20 мг/кг) и витамина Е (40 мг/кг) с возраста 1,5 мес. на количество выходов в открытые рукава (а) и время, проведенное в них (б) крыс Вистар и OXYS в приподнятом крестообразном лабиринте. # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар, * - эффект препарата (p<0,05).
Во 2-ой серииMitoQ увеличил моторную активность крыс OXYS: количество переходов в закрытые рукава выросло на 74% (p<0,04) (рис. 9б), выходов в центр - на 73% (p<0,04) и достигло уровня контрольных крыс Вистар. 
Рис. 9. Влияние 45-дневного приема MitoQ (250 нмоль/кг) с возраста 1,5 мес. на количество выходов в открытые рукава (а) и переходов в закрытые рукава (б) крыс Вистар и OXYS в приподнятом крестообразном лабиринте. # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар, * - эффект препарата (p<0,05).
Количество выходов в открытые рукава у крыс OXYS увеличилось на 123% (p<0,03), тогда как у крыс Вистар этот показатель снизился на 58% (p>0,05), что указывает на снижение тревожности крыс у OXYS и ее росте – у крыс Вистар (рис. 9а).
В 3-й серии сравнивали эффекты витамина Е и SkQ1. Последний значительно повысил тревожность крыс обеих линий: время пребывания в открытых рукавах снизилось у крыс OXYS на 94% (р<0,001), а у крыс Вистар – на 57% (р<0,001) (рис. 10б). Витамин Е на этот показатель у крыс OXYS не влиял, а у крыс Вистар, как и в 1-ой серии, снизил его на 94% (р<0,001). Оба антиоксиданта снизили количество выходов в открытые рукава крыс Вистар: SkQ1 – на 50% (р<0,001), витамин Е – на 94% (р<0,001). У крыс OXYS показатель снижался на 92% (р<0,001) и на 32% (р<0,04), соответственно (рис. 10а).
Рис. 10. Влияние 45-дневного приема SkQ1 (50 нмоль/кг) и витамина Е (20 мг/кг) с возраста 1,5 мес. на количество выходов в открытые рукава (а) и переходов в закрытые рукава (б) крыс Вистар и OXYS в приподнятом крестообразном лабиринте. # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар, * - эффект препарата (p<0,05).
Количество выглядываний, с одной стороны, отражает исследовательскую активность животных, с другой, в условиях снижения количества выходов в открытые рукава, становится показателем их тревожности. У крыс Вистар этот показатель снижался под влиянием SkQ1 (p<0,002), а у крыс OXYS – витамина Е (p<0,03). В то же время, антиоксиданты неоднозначно влияли на количество дефекаций – другой показатель тревожности животных – у крыс OXYS оба антиоксиданта снижали количество дефекаций (p<0,05), у крыс Вистар только витамин Е, как и в тесте «открытое поле», повышал его (p<0,05).
3.4.2. Влияние длительного приёма SkQ1 на поведение крыс OXYS и Вистар
Целью этого эксперимента явилось исследование возможности предупреждать возрастные изменения поведения у крыс Вистар и OXYS с помощью митохондриального антиоксиданта SkQ1. Животные получали с кормом различных доз SkQ1 с возраста 1.5 мес. в дозах 10. 50 или 250 нмоль на кг массы тела. Поведение исследовали в возрасте 12 мес. на фоне продолжающегося приёма SkQ1.
Тест «открытое поле». Как и следовало ожидать, годовалые контрольные крысы OXYS проявили все характерные для них особенности поведения в этом возрасте – сниженную моторно-исследовательскую активность и более высокий, чем у крыс Вистар, уровень тревожности (рис. 11а, б). Латентный период выхода в центр «открытого поля» был у них больше, чем у крыс Вистар (p=0,047), горизонтальная и вертикальная активность на 66% и 64% меньше (p<0,00).
Длительный прием SkQ1 не влиял на поведение крыс OXYS в тесте «открытое поле», тогда как у крыс Вистар предупредил возрастное снижение двигательной активности. У крыс Вистар, принимавших SkQ1 в дозах 10, 50 и 250 нмоль/кг, горизонтальная активность (рис. 11а) была выше, чем у животных контрольной группы (p<0,03, p<0,02 и p<0,01, соответственно). Количество вертикальных стоек (рис. 11б) SkQ1 достоверно увеличил только в дозах 50 и 250 нмоль/кг (p<0,01 и p<0,02, соответственно).
 |
Рис. 11. Влияние длительного приема SkQ1 (10, 50 или 250 нмоль/кг) с возраста 1,5 мес. на количество пересеченных квадратов (а) и вертикальных стоек (б) крыс Вистар и OXYS в приподнятом крестообразном лабиринте. Исследование поведения в возрасте 12 мес. # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар, * - эффект препарата (p<0,05).
Тест приподнятый крестообразный лабиринт. Годовалые крысы OXYS совершали меньше выходов в открытые рукава (p<0,04), но проводили в них больше времени (p<0,03), чем крысы Вистар этого возраста (рис. 12а). Данные результаты, на первый взгляд, указывают на сниженный уровень тревожности крыс OXYS. Однако детальный анализ характера их поведения в открытых рукавах лабиринта показал, что у 20% животных наблюдалась реакция фризинга - замирания в ответ на стрессовую ситуацию. Это обстоятельство и привело к тому, что крысы OXYS проводили больше времени в открытых рукавах. Следует отметить, что у крыс OXYS фризинг впервые регистрируется уже в возрасте 3 мес., а процент животных, у которых наблюдается это проявление неспецифического поведения, увеличивается с возрастом и имеет место как в приподнятом крестообразном лабиринте, так и в тесте «открытое поле». В конечном счете, это поведение животных может влиять на поведенческие показатели при тестировании и осложнять статистический анализ результатов.
Длительный прием SkQ1 повысил тревожность крыс OXYS: у животных, получавших препарат в дозе 10 нмоль/кг время, проведенное в открытых рукавах, снизилось (p<0,01), и ни одна из крыс OXYS, получавших его в дозе 50 нмоль/кг, не выходила в открытые рукава (p<0,007). Однако количество вертикальных стоек, которое у крыс OXYS было меньше, чем у крыс Вистар (p<0,00), под влиянием SkQ1 в дозе 50 нмоль/кг выросло (p<0,04). Вероятно, причиной явилось не увеличение исследовательской активности, а, скорее, повышение тревожности. SkQ1 не повлиял на активность животных в закрытых рукавах, но вследствие роста тревожности мотивация к исследовательской активности в открытых рукавах снизилась. Количество дефекаций увеличилось на 70% только у крыс Вистар, принимавших SkQ1 в дозе 250 нмоль (p<0,04) (рис. 12б).
Рис. 12. Влияние длительного приема SkQ1 (10, 50 или 250 нмоль/кг) с возраста 1,5 мес. на время, проведенное в открытых рукавах (а) и число дефекаций (б) крыс Вистар и OXYS в приподнятом крестообразном лабиринте. Исследование поведения в возрасте 12 мес. # - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар, * - эффект препарата (p<0,05).
Обучение в водном лабиринте Морриса. Латентный период нахождения невидимой платформы зависел только от генотипа животных, и был больше у крыс OXYS (рис. 13а, б). Различия по этому показателю были достоверными в 1-й (p<0,002), 2-й (p<0,001) и 3-й день тестирования (p<0,02). На 4-й и 5-й день они нивелировались, что подтверждает представленные выше результаты (см. раздел 3.1.) нарушения кратковременной памяти крыс OXYS в возрасте 16 мес. Под влиянием SkQ1 значимые межлинейные различия между крысами Вистар и OXYS исчезали – антиоксидант улучшал способность крыс OXYS к обучению, предупредил возрастные изменения показателя (рис. 13б). Крысы Вистар, получавшие SkQ1, изменили стратегию поведения в водном лабиринте Морриса, в результате чего достоверно увеличилось время пребывания животных в районе расположения платформы (р<0,01).
Рис. 13. Влияние длительного приема SkQ1 (250 нмоль/кг) с возраста 1,5 мес. на латентный период нахождения невидимой платформы крыс Вистар (а) и OXYS (б) в водном лабиринте Морриса. Исследование поведения в возрасте 16 мес. * - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар.
3.4.3. Влияние SkQ1 на поведение годовалых крыс OXYS и Вистар
Если предыдущий раздел работы был посвящен исследованию эффективности профилактического приёма антиоксиданта, то в настоящем разделе работы мы оценивали влияние SkQ1 на поведение годовалых крыс Вистар и OXYS с уже выраженными возрастными изменениями поведения. Животные получали SkQ1 с возраста 12 мес. с кормом по 250 нмоль/кг массы тела в день. Тестирование поведения было начато на фоне приёма препарата в возрасте 14 мес. Контролем служили одновозрастные интактные животные, а также интактные молодые крысы Вистар и OXYS в возрасте 3 мес.
В тесте «открытое поле» к возрасту 14 мес. двигательная и исследовательская активность животных закономерно снижалась: количество пересеченных квадратов (F1,26=46, p<0,00) и вертикальных стоек (F1,26=55, p<0,00) у крыс OXYS и Вистар было меньше, чем в 3 мес. (рис. 14а, б). Генотип влиял на горизонтальную (F1,30=8, p<0,004 и F1,56=96, p<0,00, соответственно) и вертикальную активность (F1,30=51, p<0,00 и F1,56=81, p<0,00, соответственно), которая была значительно ниже у крыс OXYS. Латентный период выхода в центр «открытого поля» зависел от возраста (F1,48=6, p=0,01), и факторы «возраст» и «генотип» взаимодействовали (F1,48=8, p=0,01): у молодых крыс OXYS показатель был достоверно выше, а, следовательно, и тревожность, чем у крыс Вистар.
SkQ1 влиял на горизонтальную активность животных (F1,56=5, p<0,03): значительно увеличил количество пересеченных квадратов у крыс OXYS (p<0,03), его эффект у крыс Вистар был выражен на уровне тенденции (рис.14а). Препарат влиял и на вертикальную активность 14-месячных животных (F1,56=7, p<0,01): увеличил количество вертикальных стоек у крыс OXYS (p<0,001) (рис.14б). В результате между 3-х месячными и принимавшими SkQ1 14-месячными животными не было достоверных различий, однако различия между крысами Вистар и OXYS сохранялись. На латентный период выхода в центр «открытого поля» влияли факторы «препарат» (F1,56=6, p<0,02) и генотип (F1,56=14, p<0,00), при этом факторы взаимодействовали (F1,56=5, p<0,02). Это было обусловлено тем, что, согласно post hoc сравнениям, SkQ1 снизил показатель у крыс Вистар (p=0,002) и не влиял на уровень тревожности крыс OXYS.
Рис. 14. Влияние 2-х месячного приема SkQ1 (250 нмоль/кг) с возраста 12 мес. на горизонтальную (а) и вертикальную (б) активность крыс Вистар и ОХYS и сравнение с 3-х месячными животными в тесте «открытое поле».
# - p<0,05 по сравнению с крысами Вистар одного возраста, ^ - p<0,05 по сравнению с 3 мес. крысами одной линии. * - эффект препарата (p<0,05).
В приподнятом крестообразном лабиринте в возрасте 14 мес. крысы Вистар и OXYS значительно меньше проводили времени в открытых рукавах (p<0,00 и p<0,02, соответственно), чем в 3 мес., а в закрытых рукавах – больше (p<0,01 и p<0,00, соответственно), что свидетельствует об увеличении уровня тревожности животных с возрастом. К возрасту 14 мес. количество переходов в закрытые рукава снижалось у крыс Вистар, оставаясь существенно выше, чем у крыс OXYS (F1,56=6, p<0,02).
Прием SkQ1 существенно снизил тревожность крыс обеих линий: количество выходов в открытые рукава (F1,56=54, p<0,00) у крыс OXYS и Вистар увеличилось в 32,2 и 9,2 раза, соответственно, а время, проведенное в них (F1,56=33, p<0,00) в 5,4 и 23 раза, соответственно (рис.15а, б). Поэтому время, проведенное в закрытых рукавах (F1,56=20, p<0,00), соответственно, уменьшалась. Однако количество переходов в закрытые рукава, которое было меньше у контрольных крыс OXYS, под влиянием SkQ1 выросло (F1,56=8, p<0,005) до уровня молодых животных.
SkQ1 увеличил и такой компонент исследовательского поведения, как количество выглядываний (F1,56=9, p<0,003): у крыс OXYS оно возросло более чем вдвое, но оставалось меньше, чем у крыс Вистар (F1,56=46, p<0,00). В возрасте 14 мес. количество вертикальных стоек у крыс OXYS было меньше, чем в 3 мес. (p<0,00), в то время как у крыс Вистар показатель не снижался (p<0,06). Поэтому, межлинейные различия (F1,56=173, p<0,00) в 3 мес. (p<0,00) с возрастом росли (p<0,00). SkQ1 увеличил показатель у животных обеих линий (F1,56=25, p<0,00): у крыс OXYS до уровня молодых животных, о
|
|
|
