 |
Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции
|
|
|
|
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Лабораторная диагностика
дифтерийной инфекции
Методические указания
МУК 4.2.3065—13
ББК 51.9
Л12
Л12 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013.—63 с.
1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, А. А. Мельникова, Н. А. Кошкина); ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (М. В. Зароченцев, И. В. Новокшонова); ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора (И. К. Мазурова, О. Ю. Борисова, С. Ю. Комбарова, В. Г. Мельников, Н. М. Максимова, Т. Н. Якимова); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» Роспотребнадзора (Н. Я. Салова, И. П. Требунских).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 14 июля 2013 г.
4. Разработаны взамен МУ 4.2.698—98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».
ББК 51.9
© Роспотребнадзор, 2013
© Федеральный центр гигиены и
эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013
|
|
|
Содержание
1. Область применения. 4
2. Общие положения. Сущность метода. 4
3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции. 9
4. Требования к взятию и транспортированию материала для бактериологической диагностики дифтерии 13
5. Организационно-методическая работа. 15
6. Бактериологическое исследование. 16
6.1. Порядок проведения бактериологического исследования. 16
6.2. Бактериологическое заключение. 20
6.3. Схема бактериологического исследования. 22
7. Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции. 23
7.1. Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии
с помощью реакции преципитации в геле. 23
7.2. Методики определения биохимических признаков. 30
8. Питательные среды.. 32
8.1. Методы приготовления питательных сред и реактивов. 34
8.2. Среды для определения биохимических свойств. 39
9. Хранение контрольных штаммов в лабораторных условиях. 42
10. Методы контроля питательных сред. 43
10.1. Метод бактериологического контроля питательных сред для
первичного посева и сред для определения токсигенных и биохимических свойств 43
10.2. Метод количественного определения аминного азота. 45
11. Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации для выявления противодифтерийных антитоксических антител (РПГА) 46
12. Нормативные и методические ссылки. 53
Приложение 1. Рецепты красок. 54
Приложение 2. Материалы и оборудование. 56
Приложение 3. Таблица и рисунки. 59
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
14 июля 2013 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции
|
|
|
Методические указания
МУК 4.2.3065—13
1. Область применения
Методические указания (далее – МУ) предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.
2. Общие положения. Сущность метода
Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за распространением токсигенных коринебактерий дифтерии. Цель бактериологического исследования – выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки: не менее трёх суток – отрицательный ответ, трёх-четырёх суток – ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии (возбудителя дифтерии), четырёх-пяти суток – ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей этого рода.
Возбудитель дифтерии – коринебактерии дифтерии (Corynebacterium diphtheriae), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин). Источником инфекции является больной или бактерионоситель токсигенных С. diphtheriae.
Нетоксигенные С. diphtheriae не вызывают дифтерийную инфекцию. «Этиологическая» значимость этих микроорганизмов при фарингите, артрите, эндокардите и др. гнойно-септических заболеваниях требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов С.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигенных свойств.
Способность С. diphtheriae вырабатывать экзотоксин опосредован феноменом фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсию нетоксигенных штаммов С. diphtheriae в токсигенные и наоборот можно воспроизвести в особых экспериментальных (лабораторных) условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией или бактерионосителей выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками – нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что токсигенные и нетоксигенные C. diphtheriae колонизировали слизистые ротоглотки и носа одновременно. При лечении антибиотиками в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Обнаружение только нетоксигенных штаммов у бактерионосителей при повторных обследованиях после лечения нельзя трактовать, как утрату способности токсигенных штаммов продуцировать экзотоксин.
|
|
|
Таксономически близкими к виду С. diphtheriae являются Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis – природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, домашних животных, способные вырабатывать дифтериеподобный экзотоксин, в редких случаях могут вызывать заболевания у человека.
Известны случаи выделения токсигенных C. ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией, а также токсигенных C. pseudotuberculosis, вызывающих лимфадениты. Инфекции, вызванные этими микроорганизмами, у человека встречаются крайне редко, не имеют эпидемического распространения, а, следовательно, значение этих случаев в медицине невелико.
На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана). Умение выделять и идентифицировать данные микроорганизмы, а также нетоксигенные С. diphtheriae служит критерием оценки качества работы бактериологов, особенно в период снижения и спорадической заболеваемости дифтерией.
C. diphthereiae растут на питательных средах, сбалансированных по своему составу, и не растут на простых питательных средах. Требуется кровь любого животного или человека (донора), как источник аминокислот, ростовых факторов, железа и пр. Не всегда коммерческие среды удовлетворяют этим требованиям, поэтому контроль качества питательных сред и всех ингредиентов в лабораториях обязателен.
Кровяные теллуритовые среды (КТА, Клауберг II) остаются лучшими селективными дифференциально-диагностическими средами, обеспечивающими рост колоний через 24 ч, что на одни сутки сокращает сроки выдачи окончательного бактериологического ответа. КТА прост в приготовлении: основой этой среды является коммерческий сухой питательный агар (СПА), в качестве кровяных добавок используют кровь, однако не исключены любые гемолизированные кровяные добавки.
|
|
|
Трудоемкость бактериологического метода и стоимость анализа сокращается при использовании двух половин одной чашки с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (далее плотная питательная среда) для посева материала из зева и носа от одного обследуемого. Использование ¼ чашки для посева таких образцов на плотной питательной среде недопустимо, так как не позволяет, в большинстве случаев, получить рост изолированных колоний и провести исследование в установленные сроки.
Посев материала из зева и носа на кровяной агар производить нецелесообразно, так как очень сложно получить рост изолированных колоний C. diphtheriae на данной среде из-за обильного роста другой сопутствующей микрофлоры.
Колонии, морфология которых характерна для микроорганизмов рода Corynebacterium, в подавляющем большинстве не подлежат микроскопии и должны быть изучены по всем необходимым идентификационным тестам. «Сомнительные» колонии с нехарактерными морфологическими свойствами подвергают микроскопии. Если в мазках обнаруживают коринеформные микроорганизмы, исследование следует продолжить по всем необходимым идентификационным тестам.
Окрашивание мазков осуществляют по Лёффлеру (щелочной метиленовый синий) или с использованием других синих красителей. Окраску по Граму не применяют, т. к. в процессе окраски клетки грамположительных C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть грамотрицательными (розовый оттенок). Чаще всего это явление наблюдают при окрашивании токсигенных C. diphtheriae (клеточная стенка токсигенных C. diphtheriae ближе по организации и структуре к грамотрицательным микроорганизмам).
В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства микробной клетки или колоний при идентификации C. diphtheriae недостаточно. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55,0 и 14,5 % случаев соответственно), когда использовали учет только морфологических признаков.
При идентификации C. diphtheriae необходим комплекс идентификационных тестов. Основной специфический тест для выявления возбудителя дифтерии, правильная постановка которого является залогом успешной диагностики дифтерийной инфекции, – определение у выделенной культуры способности к продукции дифтерийного токсина. Определять продукцию токсина следует начинать уже в первый день появления роста изолированных колоний на чашках с плотной питательной средой, исключая этап накопления чистой культуры. Не соблюдение этого правила увеличивает сроки исследования на одни сутки.
|
|
|
Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний (двадцать и более) с чашек первичного посева. При множественном росте подозрительных колоний нельзя ограничиться формированием только одной-двух бляшек. Кроме того, необходимо изучать токсигенные свойства отдельных изолированных колоний, чтобы не потерять нетоксигенные штаммы C. diphtheriae, присутствие которых также возможно при наличии токсигенных С. diphtheriae в патологическом материале.
Используют два способа постановки пробы на токсигенность:
1) модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утверждённая для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.;
2) проба Фельдмана Ю. Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях.
В пробе на токсигенность следует использовать только антитоксин – противодифтерийные антитоксические антитела, очищенные методом специфической сорбции, что позволяет избежать появления неспецифических линий преципитации микробного происхождения. В исключительных случаях при отсутствии антитоксина допускается использование лечебной противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки. В таком случае возможно появление неспецифических линий преципитации микробного происхождения, которые необходимо отличить от специфических линий токсического происхождения.
Обязательными являются биохимические тесты – на цистиназу, уреазу, расщепление глюкозы, сахарозы и крахмала. Тест на нитраты проводят только при положительной уреазной реакции. Использование других тестов, применяемых в некоторых зарубежных странах, необоснованно увеличивает продолжительность, трудоемкость, стоимость исследования и не всегда приводит к точной идентификации «недифтерийных» микроорганизмов (других представителей рода Corynebacterium). При лабораторной диагностике дифтерии не является обязательным определение видовой принадлежности «недифтерийных» коринебактерий рода Corynebacterium, тем более что их идентификация требует отдельных хемотаксономических и молекулярно-генетических методов исследования.
C. diphtheriae подразделяют на культурально-биохимические варианты (биовары) gravis, mitis, intermedius, belfanti. В бактериологической практике определению подлежат биовар gravis и объединенная группа «митисных форм» – mitis, intermedius, belfanti, т. е. группа микроорганизмов С. diphtheriae, которая не обладает амилазной активностью (не разлагает крахмал). Биовар belfanti не подлежит отдельному определению, так как этот микроорганизм не способен продуцировать экзотоксин. В бактериологической диагностике отдельного выделения биовара intermedius также не требуется, так как относительно условными дифференцирующими признаками от биовара mitis являются только размер колоний и наличие липофильности. Таким образом, в бактериологической диагностике определяются токсигенные и биохимические свойства С. diphtheriae биовара gravis и группы микроорганизмов, у которых отсутствует амилазная активность, объединённые в группу С. diphtheriae биовар mitis.
Молекулярно-генетические методы для лабораторного выявления C. diphtheriae находятся в стадии разработки. Имеющиеся тест-системы для метода ПЦР не могут различить ген дифтерийного токсина токсигенных штаммов от «молчащего» гена дифтерийного токсина нетоксигенных токснесущих штаммов C. diphtheriae, не способных продуцировать токсин из-за мутаций в этом гене. Это может привести к гипердиагностике. Поэтому их использование в лабораторной диагностике дифтерии может иметь только вспомогательное значение – поиск нетоксигенных токснесущих штаммов C. diphtheriae среди нетоксигенных штаммов.
3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции
Род Corynebacterium гетерогенный, как и группа, условно объединившая его и другие роды грамположительных палочек, не образующих споры размером 0,3—0,8 ´ 1,5—8,0 мкм, неподвижных, обладающих различной степенью полиморфизма и плеоморфизма. C. diphtheriae имеют размер 0,2—0,6 ´ 1,0—7,0 мкм. Арабиногалактановый полимер клеточной стенки C. diphtheriae отличает этот вид от всех других видов рода Corynebacterium. Клеточная стенка C. diphtheriae имеет от 3—5 до 7—9 слоёв. Известно, что клеточная стенка токсигенных C.diphtheriae лучше дифференцирована и более тонкая по сравнению с клеточной стенкой нетоксигенных C. diphtheriae и других коринеформных микроорганизмов этого рода, что определяет их отношение к антибиотикам – токсигенные более чувствительны, чем нетоксигенные к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и макролидам. Однако появляются штаммы C. diphtheriae устойчивые к некоторым антибиотикам, преимущественно выделенные от бактерионосителей.
Патогенные для животных Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis, некоторые комменсалы кожи со слизистых оболочек человека, например, Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана), Corynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum таксономически близки к виду C. diphtheriae.
Большинство видов лучше растет в аэробных условиях, в том числе и микроорганизмы вида C. diphtheriae. Вместе с тем, C. diphtheriae являются факультативными анаэробами (генерируют энергию, используя как молекулярный О2, так и органические соединения), что крайне важно учитывать при изучении их ферментативной активности.
Все коринебактерии, в т. ч. и C. diphtheriae, являются мезофилами и растут при 36—37 °С.
|
|
|
