Четвертый день (или пятый)

1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 ч инкубации пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева), положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу, после определения ее чистоты, засевают на среды для изучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой, крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной), если эта процедура не была сделана ранее.

3. Повторно (через 48 ч) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во 2 день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в пробах, поставленных в 3 день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 ч после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу, только на 4—5 сутки культуру идентифицируют как C. diphtheriae нетоксигенные, с указанием биохимического варианта.

4. При выделении токсигенных C. diphtheriae на 3—4 сутки от начала исследования дополнительно ответ о биохимических свойствах может быть выдан на 4—5 сутки (через 72 или 96 ч с момента первичного посева исследуемого материала).

6.2. Бактериологическое заключение

1. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C. diphtheriae, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.

2. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C. diphtheriae, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.

3. При выделении C. pseudodiphtheriticu m (ложнодифтерийной палочки Гофмана) или других дифтероидов, бактериологический ответ считают отрицательным.

4. При наличии линий преципитации (чаще «размытых» в виде «облачка»), идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов в нитриты, культуру относят к виду С. ulcerans, токсигенный вариант.

При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для С. ulcerans, нетоксигенный вариант, бактериологический ответ считают отрицательным.

5. C. pseudotuberculosis идентифицируется по положительной реакции в пробе на уреазу. Тест восстановления нитратов в нитриты у этих микроорганизмов является вариабельным признаком, поэтому дифференциацию от C. ulcerans проводят по крахмалу (C. pseudotuberculosis не способны разлагать крахмал – отрицательный результат). Необязательный тест для практических бактериологов – для дифференциальной диагностики С. ulcerans и C. pseudotuberculosis вводят дополнительную пробу ферментации трегалозы и гидролиз желатина. Возможно выделение токсигенных C. pseudotuberculosis.

6. При выделении C. ulcerans и C. pseudotuberculosis необходимо подтверждение подобной идентификации в Референс-центре ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора, чтобы исключить ошибки при возможном выделении C. diphtheriae.

7. Предварительный ответ при обследовании с диагностической целью и по эпидпоказаниям может быть выдан при наличии множественного роста однотипных «подозрительных» колоний на чашках первичного посева после 24 или 48 ч инкубации (на 2—3 сутки). Выявляют наличие фермента цистиназы и отсутствие фермента уреазы путем внесения в пробирки большого количества колоний. Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериологического исследования.

При нативной микроскопии (по просьбе инфекционистов) требуется дополнительный материал на тампонах из ротоглотки и носа. Однако чаще всего микроорганизмы в виде «палочек» не обнаруживают, что делает этот способ практически не пригодным.

6.3. Схема бактериологического исследования

День

Посев исследуемого материала на селективную дифференциально - диагностическую или, при необходимости, в транспортную среду. Инкубирование в термостате при 37 °C.

День (24 часа)

1. Изучение выросших колоний, при возможности – постановка пробы на токсигенность, цистиназу и посев культуры на скошенный сывороточный агар.

2. При использовании транспортной среды необходимо произвести пересев на селективную дифференциально-диагностическую среду.

3. При множественном росте, в случае необходимости, можно провести исследования для выдачи предварительного ответа – дополнительные пробы Пизу и Заксе.

День (48 часов)

1. Учет результатов проб на токсигенность и на цистиназу, поставленных во второй день исследования. В случае наличия специфических линий преципитации и при положительной пробе Пизу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий диф­терии.

2. Посев чистой культуры, выделенной во второй день исследования, на среды Гисса для изучения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

3. Повторный просмотр (через 48 ч) чашек первичного посева визуально или с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность, цистиназу и отсев колоний на скошенный сывороточный агар.

4. В случае использования транспортной среды, ход исследования см. начиная с п. 1 второго дня и далее по схеме.

5. Выдача бактериологического ответа об отсутствии коринебактерий дифтерии.

6. При обнаружении у исследуемой культуры фермента цистиназы, отсутствии фермента уреазы, можно выдать предварительный ответ о выделении дифтерийного микроба.

День (72 часа)

1. Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в 3 день исследования (через 48 ч роста первичного посева), при обнаружении специфических линий преципитации выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Определяют биохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

2. Учет биохимических свойств культуры (токсигенной или нетоксигенной), выделенной во второй день исследования (через 24 ч инкубации первичного посева).

3. Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта и дополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенных коринебактерий дифтерии, выделенных ранее.

День (96 часов)

1. Выдача бактериологического ответа о выделении токсигенных или нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта (в случае 48 ч инкубации первичного посева и 48 ч проявления или не проявления специфических линий преципитации в пробе на токсигенность).

7. Методики идентификации возбудителя
дифтерийной инфекции

7.1. Определение токсигенных свойств коринебактерий
 дифтерии с помощью реакции преципитации в геле

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (модифицированный тест Элека с бумажными полосками и тест Фельдмана с соавт. с бумажными дисками) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии со среды первичного посева или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными на скошенной сывороточно-агаровой среде или после рассева на КТА чистыми культурами.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном (стеклянные или одноразовые пластиковые), питательную среду – сухую коммерческую питательную среду для определения токсигенности или агар Мартена, нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота (СКРС), стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 0,7 см ´ 8,0 см, или бумажные диски диаметром 0,6 см, очищенный ферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (в дальнейшем именуется антитоксин), при отсутствии которого в исключительных случаях можно использовать противодифтерийную антитоксическую сыворотку лошадиную, лечебную (в дальнейшем именуется антитоксическая сыворотка). Лучше использовать коммерческие или приготовленные в лаборатории бумажные диски, пропитанные антитоксином. Обязательным является использование контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии биовара gravis 24—48-часового роста.

7.1.1. Методика определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с использованием бумажных дисков с антитоксином
(по Фельдману с соавт.)

Приготовление чашек для постановки пробы на токсигенность

Питательный агар для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки). При большом объеме работы питательный агар разливают во флаконы по 70—80 мл (на 7—8 чашек пробы на токсигенность). Питательный агар следует расплавлять только 1 раз; многократное плавление ухудшает свойства среды. Питательный агар расплавляют в водяной бане при 90 °C, тотчас же вынимают из бани, охлаждают до 50 °C и добавляют 20 % сыворотки крупного рогатого скота. Так, к 10 мл питательного агара добавляют 2 мл сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), перемешивают и выливают, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри, распределяют среду по дну осторожным вращением чашки, не допуская «вспенивания» – появления неровностей на поверхности среды.

Чашку подсушивают в термостате при 37 °C в течение 15—20 мин, при открытой крышке, повернув ее вверх дном, до нанесения бумажных дисков с антитоксином на поверхность среды. Чашки с питательной средой недопустимо пересушивать.

В редких случаях, когда на чашках первичного посева вырастают единичные колонии (не более 8), токсигенные свойства которых надлежит изучить, возможно использование полистироловых чашек Петри диаметром 4,5 см. Количество питательного агара и СКРС уменьшается (3,2 мл питательного агара 1,8 % + 0,8 мл СКРС).

Чашки со средой для определения токсигенности хранить не рекомендуется.

Приготовление бумажных дисков с дифтерийным антитоксином

Диски из плотной фильтровальной бумаги нарезают диаметром 6 мм, стерилизуют автоклавированием при 2 атм. в течение 20—30 мин, высушивают и пропитывают антитоксином, разведенным в 1 мл дистиллированной воды (500 МЕ в 1 мл). Достаточно 1 мл антитоксина для приготовления 80—100 дисков, 1 диск содержит (5 ± 1) МЕ дифтерийного антитоксина. Далее диски подсушивают в термостате (соблюдая асептические условия) в течение 18—24 ч. Готовые диски помещают в стерильный флакон или пробирку с силикагелем или другим гигроскопическим веществом и сохраняют в холодильнике при 4—6 °С.

Постановка пробы на токсигенность

На поверхность чашки Петри со средой для определения токсигенности дифтерийных микробов помещают четыре бумажных диска с дифтерийным антитоксином. Вокруг каждого диска с антитоксином формируют 5 «бляшек»: две «бляшки» – контрольного штамма и три – испытуемые (из одного анализа с подозрительными колониями формируют минимум две «бляшки» из изолированных колоний и одну – из смеси 3—6 однотипных колоний; материалом из этого же анализа можно занять места вокруг других дисков с антитоксином). Все пять «бляшек» располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,7 см от его края. Диаметр каждой «бляшки» 0,6—0,7 см. На одной чашке Петри можно разместить до четырех дисков с антитоксином и, соответственно, до 20 «бляшек» с культурами (8 «бляшек» контрольных и 12 «бляшек» испытуемых). Бумажные диски расставляют на поверхности сывороточно-агаровой среды на максимально удаленном расстоянии между дисками, чтобы не произошло перекрестных реакций (рис. 3).

Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °C.

Учет результатов

Результат реакции учитывают через 18—24 часа, а также – через 48 ч. Наличие линий преципитации между диском с антитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о ее токсигенности. Исследуемая культура считается токсигенной, если линия преципитации данной культуры сливается под углом с линией преципитации контрольного штамма. Отсутствие линий преципитации у испытуемых культур через 48 ч, при наличии их у контрольных штаммов, указывает на отсутствие токсигенности у изучаемых культур. Линии преципитации у контрольных штаммов должны появляться через 18—24 ч. Более позднее появление линий преципитации требует проверки качества питательной среды, проверки чистоты контрольного штамма, или улучшения его фенотипических свойств при выращивании на кровяном агаре, или замены контрольного штамма.

7.1.2. Методика определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с использованием бумажных полосок
(по модифицированному тесту Элека)

Чашки для постановки пробы на токсигенность этим методом готовят так же, как при работе с бумажными дисками (чашки диаметром 4,5 см не используют). В центр чашки на поверхность застывающего агара обожженным пинцетом помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксином (или в редких случаях при отсутствии антитоксина используют антитоксическую лечебную лошадиную сыворотку). Чашку с бумажной полоской с антитоксином подсушивают в термостате при 37 °C в течение 15—20 мин при открытой крышке, повернув ее вверх дном. Приготовленные таким способом чашки не подлежат хранению.

Приготовление бумажных полосок с антитоксином

Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером (0,7 ´ 8,0) см, заворачивают по 2—4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 30 мин. Пакетики с бумажными полосками хранят в стерильной чашке Петри до 3 недель. Важным является сохранение ровных краев полоски и отсутствие грифельной черты при рисовании их на фильтровальной бумаге.

Перед постановкой пробы на токсигенность содержимое ампулы с антитоксином растворяют в 1 мл стерильного физиологического раствора, переносят в стерильную пробирку и указывают на ней данные этикетки (растворенный антитоксин хранят при температуре 4—6 °C не более 10 дней). Фильтровальные бумажки обожженным пинцетом помещают в стерильную чашку Петри, где на каждую полоску наносят 0,125 мл антитоксина, содержащего 500 ME в 1 мл.

Постановка пробы на токсигенность с бумажными полосками с антитоксином

Культуру засевают в виде «бляшек» диаметром 0,6—0,7 см на расстоянии 0,7—0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 «бляшек» (по 5 «бляшек» с каждой стороны полоски). Из них 6 «бляшек» испытуемой культуры, 4 – контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных «бляшек» и 4 – испытуемых. Материал от одного анализа засевают параллельными «бляшками» по обе стороны полоски с антитоксином (рис. 4А).

Чашки с посевом помещают в термостат при 37 °C.

Учет результатов

Результат учитывают через 18—24 ч и 48 ч от начала постановки пробы на токсигенность. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма, чаще всего это может произойти через 48 ч, через 24 ч намечается только тенденция к слиянию. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации (рис. 4Б), что практически не наблюдается при использовании антитоксина, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Если через 18—24 ч от момента постановки пробы на токсигенность у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции. Необходимо проверить качество питательной среды или улучшить фенотипические свойства контрольного штамма, пассируя его на кровяной агаровой среде, или заменить контрольный штамм.

Оценка результатов реакции пробы на токсигенность
при использовании бумажных дисков или полосок с антитоксином

Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образовавшиеся линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. Результаты достоверны через 24 или 48 ч от начала постановки пробы на токсигенность.

Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если не образуются линии преципитации с антитоксином при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма. Результаты можно считать достоверными только через 48 ч от начала постановки пробы на токсигенность.

Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин не содержит антител к компонентам микробной клетки. При использовании этого препарата неспецифические линии преципитации не образуются (при условии его высокого качества).

7.1.3. Определение токсигенных свойств С. diphtheriae в реакции
преципитации в геле (модифицированном тесте Элека)
с использованием бумажных полосок с противодифтерийной
антитоксической лечебной лошадиной сывороткой

В редких случаях при отсутствии или некачественной работе антитоксина применяют противодифтерийную антитоксическую лечебную лошадиную сыворотку.

Приготовление чашек

Питательный агар для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки). При большом объеме работы питательный агар разливают во флаконы по 70—80 мл (на 7—8 чашек пробы на токсигенность). Питательный агар следует расплавлять только 1 раз, многократное плавление ухудшает свойства среды. Питательный агар расплавляют в водяной бане при 90 °C, тотчас же вынимают из бани, охлаждают до 50 °C и добавляют 20 % сыворотки крупного рогатого скота. Так, к 10 мл питательного агара добавляют 2 мл сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), перемешивают и выливают, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри, распределяют среду по дну осторожным вращением чашки, не допуская «вспенивания» – появления неровностей на поверхности среды.

В центр чашки на поверхность застывающего агара обожженным пинцетом помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической лечебной лошадиной сывороткой. Чашку с бумажной полоской подсушивают в термостате при 37 °C в течение 15—20 мин, при открытой крышке, повернув ее вверх дном. Приготовленные таким способом чашки не подлежат хранению.

Приготовление бумажных полосок

Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером (1,5 ´ 8,0) см, заворачивают по 2—4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 30 мин. Пакетики с бумажными полосками хранят в стерильной чашке Петри до 3 недель.

Разведение антитоксической сыворотки

Соблюдая правила асептики, антитоксическую сыворотку переносят из ампулы в стерильную пробирку. На пробирке указывают данные этикетки и срок хранения. Хранят сыворотку при температуре 4—6 °C.

Сыворотка должна быть разведена стерильным физиологическим раствором до содержания 500 ME в 1 мл. Коммерческий препарат может иметь разную активность (5 000 ME, 10 000 ME, 20 000 ME) и различный объем.

Например, в ампуле содержится 10 000 ME (в объеме 4,8 мл, как указано на этикетке коробки с ампулами) антитоксической сыворотки. Для упрощения расчетов общий объем сыворотки можно принять за 5 мл. Следовательно, в 1 мл сыворотки содержится 2 000 ME (10 000 ME: 5 = 2 000 ME). Чтобы получить 500 ME в 1 мл, следует 1 мл сыворотки развести в 4 раза, т. е. к 1 мл сыворотки добавить 3 мл стерильного физиологического раствора. При необходимости можно развести сыворотку в меньших объемах: к 0,1 мл сыворотки добавить 0,3 мл физиологического раствора или к 0,2 мл сыворотки добавить 0,6 мл физиологического раствора, или к 0,3 мл сыворотки добавить 0,9 мл физиологического раствора и т. д.

Разведение сыворотки можно выполнить другим способом. Если, например, в ампуле содержится 5 000 ME сыворотки в объеме 2,5 мл, то 500 ME содержится в 0,25 мл сыворотки. К этому объему добавляют 0,75 мл стерильного физиологического раствора и получают разведение сыворотки 500 ME в 1 мл.

Разведенную сыворотку можно хранить до 7 дней при температуре 4—6 °C.

Постановка пробы на токсигенность

Культуру засевают в виде «бляшек» диаметром 0,6—0,7 см на расстоянии 0,7—0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 «бляшек». Из них 6 «бляшек» испытуемой культуры, 4 – контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных «бляшек» и 4 – испытуемых (рис. 4Б). Чашки с посевом помещают в термостат при 37 °C.

Учет результатов

Результат учитывают через 18—24 ч и 48 ч роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии (рис. 4Б). Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48—72 ч, в редких случаях могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18—24 ч от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции. Необходимо проверить качество питательной среды, или улучшить фенотипические свойства контрольного штамма, пассируя его на кровяной агаровой среде, или заменить контрольный штамм.

Варианты оценки результатов реакции:

1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма.

2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если линии преципитации:

а) образуемые испытуемой культурой, отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;

б) не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии);

в) испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;

г) испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.

7.2. Методики определения биохимических признаков

7.2.1. Определение цистиназной активности (проба Пизу)

В отличие от C. pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийной палочки Гофмана), C. pseudotuberculosis и многих других коринеформных бактерий, C. diphtheriae и C. ulcerans обладают ферментом цистиназой.

Испытуемую культуру засевают петлей «уколом» в питательную среду для определения цистиназы, разлитую в узкие пробирки столбиком высотой 3—4 см. Посев производят строго в центре агарового столбика до дна пробирки. Для получения оптимального результата целесообразно использовать длинную бактериологическую петлю.

В составе питательной среды имеется цистин и уксусно-кислый свинец. В процессе роста культура продуцирует цистиназу, расщепляющую цистин; а образующийся при этом сероводород вступает в реакцию с уксусно-кислым свинцом, который превращается в серно-кис­лый свинец – соединение темно-коричневого цвета. Коринебактерии дифтерии и коринебактерии ульцеранс вызывают не только почернение среды по ходу укола, но и образуют вокруг него облачко темно-коричне­вого цвета на расстоянии примерно 1 см от поверхности среды. Результат реакции учитывают через 24 ч. При наличии множественного роста, для получения ускоренного (предварительного) ответа через 3 ч, среду инокулируют большим количеством культуры.

Одновременно с испытуемыми культурами в качестве положительного контроля производится посев контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии биовара gravis в отдельную пробирку.

7.2.2. Определение уреазной активности

C. pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана), C. ulcerans, C. pseudotuberculosis и некоторые другие микроорганизмы рода Corynebacterium обладают способностью продуцировать в процессе роста фермент уреазу и расщеплять мочевину. C. diphtheriae такой способностью не обладают.

Пробу на уреазу можно ставить в 2 вариантах – по методу Заксе (а) и путем посева на бульон с мочевиной (б).

а) Для определения уреазы по методу Заксе ex tempore смешивают
1 часть реактива А и 19 частей реактива В. Смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл и вносят одну петлю испытуемой чистой культуры со скошенного агара или из пробирки со средой Пизу. Для выдачи ускоренного (предварительного) ответа, при наличии множественного роста однотипных колоний на чашке первичного посева, допускается внесение нескольких колоний в одну пробирку с пробой на уреазу. Результат учитывают после инкубации в термостате при 37 °C в течение 30 мин.

б) Чистую культуру коринебактерий дифтерии засевают в бульон с мочевиной, разлитый в пробирки по 2—3 мл, и помещают в термостат, результат учитывают через 24 ч инкубации при 37 °C.

Фермент уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака и углекислоты. При этом повышается pH среды и происходит изменение цвета индикатора (покраснение). При отсутствии у исследуемой культуры этого фермента окрашивания среды не происходит. В качестве положительного контроля в отдельную пробирку засевают контрольный штамм – C. pseudodiphtheriticum или C. ulcerans.

7.2.3. Определение сахаролитической активности

Для идентификации C. diphtheriae используют также оценку сахаролитической активности выделенных культур на средах Гисса с углеводами – глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом.

Каждую пробирку со средой Гисса инокулируют 1 петлей чистой культуры. Результат учитывают через 24 ч, а при отрицательном крахмальном признаке – через 48 ч культивирования посевов в термостате при 37 °C.

При сбраживании того или иного углевода образуется кислота, происходит восстановление обесцвеченного фуксина и среда приобретает малиновую окраску.

В качестве положительного контроля в отдельную пробирку производится посев контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis и C. pseudodiphtheriticum.

7.2.4. Определение нитратредуктазной активности

Способность C. diphtheriae восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) является дополнительным признаком, позволяющим отличать их от C. ulcerans и C. pseudotu­ berculosis, которые не обладают нитратредуктазой.

Производят посев исследуемой культуры в пробирку с нитратным бульоном, инкубируют в течение 24 ч при температуре 37 °C. Затем добавляют 2—3 капли реактива на нитриты (Грисса или Касаткина). В случае, если произошло образование нитритов, среда окрашивается в красный цвет. Если микроорганизм не обладает нитратредуктазой, изменения окраски среды не происходит.

В качестве положительного контроля в отдельную пробирку производится посев контрольного штамма C. diphtheriae биовара gravis; в качестве отрицательного контроля инкубируют пробирку со стерильной средой без культуры. Дополнительными тестами могут служить постановка пробы с C. ulcerans (если имеется в лаборатории) и C. pseudodiphtheriticum.

8. Питательные среды

Качество питательных сред имеет важнейшее значение при любом бактериологическом исследовании. Чтобы добиться максимальной высеваемости коринебактерий дифтерии из исследуемого материала и роста колоний, видимых невооруженным глазом через 24 ч, необходимо создать оптимальные условия для роста, размножения этих бактерий, сохранения их биологических и культурально-морфологических свойств, а также для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры. Это достигается путем использования универсальных питательных основ с добавлением крови и теллурита калия. Теллурит калия в определенной концентрации не препятствует росту представителей рода коринебактерий и практически полностью ингибирует рост посторонней микрофлоры. Кровяные теллуритовые среды являются также дифференциально-диагностическими, поскольку колонии коринебактерий на этих средах имеют серую или черную окраску (данные микроорганизмы способны восстанавливать теллурит калия до металлического теллура, вещества черного цвета, и накапливать его внутри клеток).

Лучшими питательными средами для первичного посева материала являются кровяные теллуритовые среды – КТА, Клауберг II. В качестве основы для этих сред используют сухой питательный агар (СПА), питательный агар на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ГРМ), можно использовать среду АГВ, применяемую в бактериологической практике для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, однако колонии на АГВ всегда меньше по размеру, чем на других средах. Из всех перечисленных агаровых основ наиболее сбалансированным по составу является СПА.

Питательные агары готовят по прописи на этикетке и ex tempore добавляют кровь или глицериновую смесь, теллурит калия.

На питательных средах без крови значительно снижается высеваемость (в 2—3 раза), замедляется рост колоний (через 24 ч на чашках первичного посева колонии либо мелкие, либо отсутствуют, рост которых наблюдается только через 48 ч), изменяется морфология колоний, ингибирующая способность значительно ниже при замене теллурита калия на другие ингибиторы (например, хинозол). Поэтому следует не применять сывороточную среду Тинсдаля ни для первичного посева материала, ни для изучения цистиназной активности, ограничить использование среды Бучина, т. к. используется только 5 мл крови и ингибитор – хинозол. Для выделения коринебактерий дифтерии выпускается также коммерческая питательная среда Коринебакагар, в которую, согласно прописи по приготовлению, не нужно добавлять кровь. Однако данная среда уступает кровяным средам по ингибирующей активности и ростовым свойствам (образуются колонии меньшего размера на первые сутки или же они могут появляться только на вторые сутки роста).

Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии выпускается коммерческая сухая среда ОТДМ и Коринетоксагар. Коммерческие среды готовят по прописи на этикетке, добавляя ex tempore нужные ингредиенты.

В лабораторных условиях готовят Мартеновский пептон для приготовления Мартеновского агара, как лучшей основы для среды на токсигенность и определения цистиназы.

Для отсева колоний и культивирования коринебактерий дифтерии готовят сывороточную агаровую среду. Применение свернутой сыворотки является нецелесообразным.

В лабораторных условиях готовят транспортную среду для сохранения и накопления коринебактерий дифтерии, которую используют при транспортировании исследуемого материала. Коммерческого выпуска этой среды нет.

Каждая новая серия питательной среды (как коммерческой, так и приготовленной в лабораторных условиях) подлежит бактериологическому контролю. В тех случаях, когда ростовые свойства питательной среды не удовлетворяют предъявляемым требованиям, питательные агаровые основы готовят на бульонах - сухой питательный бульон (СПБ), ГРМ-бульон и бульонах, приготовленных в лабораторных условиях (перевар Хоттингера, 1 % пептонная вода, с содержанием аминного азота 150—180 мг/%).

Питательные среды для первичного посева разливают по чашкам Петри слоем 3—4 мм. Они могут быть использованы в течение 3 суток при условии хранения при температуре 4—6 °C.

8.1 Методы приготовления питательных сред и реактивов

8.1.1. Транспортная среда (среда накопления)

В качестве основы для приготовления транспортной среды используют 0,1 % питательный агар на переваре Хоттингера или 0,1 % агар на коммерческом сухом питательном бульоне (ГРМ-бульон), pH 7,6. Лучшей основой является Мартеновский бульон.

Среду разливают в пробирки по 4 мл, стерилизуют в автоклаве при 1 атм. в течение 20 мин. Срок хранения – до 1 месяца при 4—6 °C. Перед употреблением в каждую пробирку, с соблюдением правил асептики, добавляют 0,5—1,0 мл сыворотки крупного рогатого скота и по 0,05 мл (1 капля) 2 % раствора теллурита калия. Среду выборочно контролируют на стерильность, выдерживая при 37 °C в течение 48 ч. Срок хранения готовой среды – 10 дней при 4—6 °C.

8.1.2. Среды для первичного посева исследуемого материала

Среда Клауберга II

К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (pH 7,6), расплавленной и охлажденной до 50 °C, добавляют 10 мл глицериновой смеси, 50 мл «лаковой» крови и 3 мл 2 % раствора теллурита калия. Принимая во внимание, что питательная среда разводится глицериновой смесью и «лаковой» кровью в 1,6 раза, при приготовлении данной среды следует увеличить навеску сухого питательного агара в 1,6 раза.

Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческим питательным агаром указана навеска, необходимая для приготовления 1 л среды, например, 30 г. Для приготовления 1 л питательной основы для среды Клауберга II следует взять навеску 48 г (т. е. 30 г ´ 1,6 = 48 г).

Для приготовления глицериновой смеси к 40 мл дефибринированной крови или кровяной смеси добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуют при температуре 110 °C в течение 30 мин).

Для приготовления «лаковой» крови к 34 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови.

Кровяной теллуритовый агар (КТА)

К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (pH 7,6), расплавленной и охлажденной до 50 °C, добавляют 7 мл дефибринированной или 10 мл гемолизированной крови и 2 мл 2 % раствора теллурита калия. Вместо крови можно использовать кровяную теллуритовую смесь (11 мл на 100 мл среды), при этом на 100 мл КТА добавляют ex tempore 1 мл 2 % раствора теллурита калия, т. к. 1 мл 2 % раствора уже содержится в 11 мл кровяной теллуритовой смеси. Принимая во внимание, что питательная среда разводится кровью примерно в 1,1 раза, при приготовлении данной среды следует увеличить навеску сухого питательного агара в 1,1 раза.

Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческим питательным агаром указана навеска, необходимая для приготовления одного литра среды, например, 30 г. Для приготовления 1 л питательной основы для КТА следует взять навеску 33 г (т. е. 30 г ´ 1,1 = 33 г).

8.1.3. Методика приготовления кровяных, кровяно-теллуритовых
смесей и сывороточ

⇐ Предыдущая1234Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: