 |
Приготовление рабочего разведения эритроцитов барана контрольных (КЭ).
|
|
|
|
Контрольные эритроциты разводят ФБР без твина в 8 раз (к 7,0 мл ФБР без твина добавляют 1,0 мл КЭ). КЭ при проведении РПГА макрометодом не разводят.
Подготовка исследуемых сывороток
Исследуемую сыворотку человека перед определением уровня дифтерийного антитоксина разводят в 5 раз 0,85 % свежеприготовленным раствором хлорида натрия. Для этого к 0,1 мл исследуемой сыворотки добавляют 0,4 мл 0,85 % раствора хлорида натрия для микрометода, для макрометода к 0,2 мл исследуемой сыворотки добавляют 0,8 мл 0,85 % раствора хлорида натрия. Разведенную сыворотку прогревают в течение 30 мин в водяной бане (термостате) при температуре 56 °C. Разведенную и прогретую сыворотку адсорбируют эритроцитами барана, формалинизированными 50 %, которые перед использованием встряхивают до получения гомогенной взвеси. Эритроциты добавляют из расчета 0,05—0,1 мл на 1,0 мл разведенной сыворотки, выдерживают 15—20 ч при температуре 2—8 °C. После сорбции прозрачная надосадочная жидкость готова к исследованию (без предварительного центрифугирования).
Проведение реакции пассивной гемагглютинации
(микрометод/макрометод)
Контроль на активность диагностикума и отсутствие спонтанной агглютинации
Перед исследованием сывороток следует на отдельном планшете провести контроль на активность диагностикума и отсутствие спонтанной агглютинации. Для этого в два ряда по 12 лунок планшета вносят по 0,025 разведенного ФБР с твином для микрометода (по 0,4 мл для макрометода). После этого в 1 лунку ряда вносят 0,025 мл СДК разведенной 1: 100 (по 0,4 мл для макрометода), получают разведение 1: 200, содержимое лунки тщательно перемешивают и, перенося по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую (по 0,4 мл для макрометода), делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из десятой лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл (0,4 мл для макрометода), а затем во все лунки с 1 по 12 закапывают по 0,025 мл диагностикума (0,05 мл для макрометода). 11 и 12 лунки являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации.
|
|
|
Контроль на активность диагностикума следует ставить для каждого флакона с диагностикумом из набора перед проведением исследований испытуемых сывороток. Разведенный диагностикум может быть использован в течение суток, если его активность соответствует требуемой.
Исследование испытуемых сывороток(микрометод)
Во все лунки планшета вносят по 0,025 мл разведенного ФБР с твином.
В 1 лунку ряда вносят 0,025 мл разведенной в 5 раз прогретой, адсорбированной испытуемой сыворотки, тщательно перемешивают, получают разведение 1: 10 и, перенося по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из 10 лунки после перемешивания удаляют 0,025 мл. Следует отметить, что в каждой из лунок перемешивание необходимо производить не менее 3 раз, а затем содержимое переносить в последующую лунку. При больших объемах исследований для экономии всех ингредиентов титрование сывороток можно проводить в 8 лунках «по короткому ряду» планшета.
Для контроля на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана, при постановке РПГА «по длинному ряду», в 11 лунку вносят 0,025 мл испытуемой сыворотки, прогретой, адсорбированной, разведенной 1: 5, перемешивают и переносят 0,025 мл в 12 лунку. Из 12 лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл. В 11 и 12 лунки с испытуемой сывороткой вносят по 0,025 мл рабочего разведения контрольных эритроцитов барана. При титровании «по короткому ряду» этот контроль для испытуемых сывороток ставят на специально выделенном для этого планшете. Флакон с разведенным диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов и вносят по 0,025 мл диагностикума с 1 до 10 лунку включительно (или с 1 до 8 лунки с разведениями испытуемых сывороток при постановке реакции «по короткому ряду»).
|
|
|
Равномерное распределение эритроцитов в лунках планшета достигается путем постукивания по его углам. Планшеты оставляют на ровной поверхности в течение 2,5—3,5 ч при температуре 20—22 °C. Перемещение планшетов до учета результатов реакции не допускается. В исключительных случаях учет результатов реакции возможен через 18—22 ч.
Исследование испытуемых сывороток(макрометод)
Во все лунки планшета вносят по 0,4 мл разведенного ФБР с твином.
В 1 лунку ряда вносят 0,4 мл разведенной в 5 раз прогретой, адсорбированной испытуемой сыворотки, тщательно перемешивают, получают разведение 1: 10 и, перенося по 0,4 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из 10 лунки после перемешивания удаляют 0,4 мл. Следует отметить, что в каждой из лунок перемешивание необходимо производить не менее 3 раз, а затем содержимое переносить в последующую лунку. При больших объемах исследований для экономии всех ингредиентов титрование сывороток можно проводить в 8 лунках «по короткому ряду» планшета.
Для контроля на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана, при постановке РПГА «по длинному ряду», в 11 лунку вносят 0,4 мл испытуемой сыворотки, прогретой, адсорбированной, разведенной 1: 5, перемешивают и переносят 0,4 мл в 12 лунку. Из 12 лунки, после перемешивания, удаляют 0,4 мл. В 11 и 12 лунки с испытуемой сывороткой вносят по 0,05 мл рабочего разведения контрольных эритроцитов барана. При титровании «по короткому ряду» этот контроль для испытуемых сывороток ставят на специально выделенном для этого планшете. Флакон с диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов и вносят по 0,05 мл диагностикума с 1 до 10 лунку включительно (или с 1 до 8 лунки с разведениями испытуемых сывороток при постановке реакции «по короткому ряду»).
Планшеты оставляют на ровной поверхности в течение 2,5—3,5 ч при температуре 20—22 °C. Перемещение планшетов до учета результатов реакции не допускается. В исключительных случаях учет результатов реакции возможен через 18—22 ч.
|
|
|
Учет и интерпретация результатов
Результаты РПГА оценивают визуально – по степени агглютинации эритроцитов:
++++ гемагглютинат тонким слоем выстилает все дно лунки, напоминая по форме перевернутый купол, края которого могут заворачиваться;
+++ агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают дно лунки, но размер агглютината меньше, может наблюдаться фестончатое утолщение края осадка;
++ агглютинировавшие эритроциты располагаются в центральной части лунки, окружены слоем эритроцитов в виде кольца;
+ на дне лунки образуется широкое, плотное кольцо с незначительной агглютинацией по краю;
– осадок в центральной части лунки в виде диска или кольца с ровным краем.
За титр испытуемой и контрольной сывороток принимают последнее разведение, дающее агглютинацию эритроцитов на два креста (++).
Реакция в контролях на отсутствие в испытуемой сыворотке агглютининов к эритроцитам барана и на отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума должна быть отрицательной. Если испытуемая сыворотка в лунках с контрольными эритроцитами дает гемагглютинацию, нужно повторно адсорбировать из нее гетерогемагглютинины: то есть повторно провести обработку сыворотки 50 % формалинизированными эритроцитами. Это явление встречается крайне редко.
При определении специфической активности (чувствительности) диагностикума, агглютинация на два креста с сывороткой противодифтерийной контрольной должна быть не ниже 1: 3 200 и не выше 1: 12 800, что соответствует 5—7 лункам. В противном случае диагностикум бракуется и реакция не учитывается. (Активность столбнячного диагностикума с противостолбнячной контрольной сывороткой должна быть не ниже 1: 1 280 и не выше 1: 5 120, что соответствует 5—7 лункам.)
Условно-защитным титром как противодифтерийных, так и противостолбнячных антител принимается титр 1: 20.
Испытуемые сыворотки с титром противодифтерийных антитоксических антител 1: 20 и менее подлежат повторному исследованию в РПГА с использованием уже разведенной 1: 5, прогретой, адсорбированной эритроцитами барана сыворотки. При наличии достаточного количества нативной сыворотки ее вновь разводят 1: 5, прогревают, сорбируют эритроцитами барана и исследуют в РПГА. За окончательный результат исследования принимают более высокий титр.
|
|
|
Количественные показатели содержания антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови, полученные с помощью РПГА (в титрах), не переводят в другие единицы измерения количества антител.
Техника безопасности при постановке РПГА
Все мероприятия по технике безопасности при постановке РПГА проводятся в установленном порядке.
12. Нормативные и методические ссылки
1. СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
2. СП 1.2.036—95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности».
3. СанПиН 2.1.7.2790—10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».
4. СП 3.1.2.1108—02 «Профилактика дифтерии».
5. МУ 3.1.2.3018—12 «Эпидемиологический надзор за дифтерийной инфекцией».
6. МУ 3.1.2943—11 «Организация и проведение серологического мониторинга состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит, гепатит B)».
Приложение 1
Рецепты красок
|
|
|
