Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Генетика соматических клеток. Метод соматической гибридизации и его применения для картирования хромосом человека. Значение для медицины.




Тот факт, что соматические клетки несут в себе весь объем генетической информации, дает возможность изучать на них генетические закономер­ности всего организма.

Основу метода составляет культиви­рование отдельных соматических кле­ток человека и получение из них клонов, а так же их гибридизацию и селекцию.

Соматические клетки обладают ря­дом особенностей:

- быстро размножаются на питатель­ных средах;

- легко клонируются и дают генети­чески однородное потомство;

- клоны могут сливаться и давать ги­бридное потомство;

- легко подвергаются селекции на специальных питательных средах;

- клетки человека хорошо и долго сохраняются при замораживании.

Соматические клетки человека по­лучают из разных органов — кожи, костного мозга, крови, ткани эмбрионов. Однако чаще всего используют клетки соединительной ткани (фибробласты) и лимфоциты крови.

С помощью метода гибридизации соматических клеток:

а) изучают метаболические процес­сы в клетке;

б) выявляют локализацию генов в хромосомах;

в) исследуют генные мутации;

г) изучают мутагенную и канцеро­генную активность химических ве­ществ.

В 1960 г. былопоказано, что совмест­но культивируемые клетки различных линий могут сливаться, образуя гибри­ды, содержащие геномы обеих роди­тельских форм. Первые такие гибриды были получены при слиянии клеток разных линий мышей. Наряду с внут­ривидовыми получены и межвидовые гибриды, например, между клетками человека и мыши, мыши и хомячка, мыши и курицы и др. Образование ги­бридных клеток происходит чаще, если в культуру добавлены некоторые веще­ства (например, полиэтиленгликоль) или инактивированный вирус Сендай.

При гибридизации соматических клеток двух разных линий образуются гетерокарионы — клетки, которые со­держат оба родительских ядра. Затем в результате митоза и деления образу­ются две одноядерные клетки — синкарионы, имеющие хромосомы обоих родительских клеток.

В течение первых делений гибрид­ной клетки, не ясно почему, происхо­дит потеря хромосом одного из видов. Так, у гибридов мышь-хомячок элими­нируются хромосомы мыши. Если присутствие продукта изучаемого гена коррелирует с наличием определенной хромосомы в гибриде, то можно пред­положить, что этот ген локализован в данной хромосоме.

Потеря хромосом в гибридных клет­ках мышь — человек происходит слу­чайно

Какая хромосома человека со­хранится — предугадать невозможно. Через определенное число поколений в гибридной клетке сохранятся все хро­мосомы мыши и несколько (в среднем 7) хромосом человека. Однако некото­рые клетки могут содержать одну-две пары хромосом, другие — 7, а некото­рые — до 20 хромосом человека. Вмес­те с тем из всей популяции гибридных клеток можно отобрать стабильные клоны (клон — потомство одной клет­ки), содержащие конкретные человече­ские хромосомы, и провести в них кар­тирование генов.

Гибридные клетки человека и мыши имеют 43 пары хромосом: 23 от человека и 20 от мыши. В дальнейшем проис­ходит элиминация хромосом того ви­да, клетки которого медленнее размно­жаются. При этом хромосомы мыши сохраняются, а хромосомы человека утрачиваются.

Функционирующие в гибридных клетках хромосомы синтезируют опре­деленные белки. Фенотипически хро­мосомы мыши и человека отличаются. Нетрудно определить, какие хромосо­мы присутствуют в гибриде и выяс­нить, синтез каких белков связан с данными хромосомами человека. Обычно гибридные клетки теряют хромосомы целиком, поэтому, если ка­кие-либо гены присутствуют или от­сутствуют вместе, то они могут быть отнесены к одной хромосоме

Это поз­воляет картировать хромосомы чело­века. В ряде случаев для картирования используют хромосомные перестрой­ки, что дает возможность установить локализацию генов в определенном участке хромосомы, определить после­довательность их расположения, т. е. построить карты хромосом человека.

В настоящее время выяснено, что в Х-хромосоме локализовано 95 генов, в 1-й аутосоме — 24 гена. Ген, определя­ющий группы крови по системе АВО, расположен в 9-й хромосоме, группы крови по системе MN во 2-й хромосо­ме, а по системе резус- фактора (Rh) — в 1-й хромосоме.

Использование метода гибридиза­ции соматических клеток дает возмож­ность изучать механизмы первичного действия генов и их взаимодействия, что расширяет возможности точной диагностики наследственных болезней на биохимическом уровне.

Использование новых методов и под­ходов к картированию хромосом позво­лило обнаружить в геноме человека сверхизменчивые участки ДНК (мини­сателлиты), характерные для каждого человека. Одновременно были выделе­ны последовательности ДНК, изменяю­щиеся с повышенной частотой. Они ло­кализованы по всему геному и имеют разное число копий

­Эта дисциплина изучает наследственность и изменчивость соматических клеток, используя культуру клеток различных тканей и органов.

Методы:
1. Простое культивирование
2. Гибридизация — слияние клеток разных типов например клетки человек — мышь постепенно теряют хромосомы; можно устанавливать группы сцепления по исчезающим прзнакам
3. Клонирование — получение потомства из 1 клетки, нопример гибридом.

4. Селекция — отбор клеток с заранее заданными свойствами.

Практическое значение метода соматической гибридизации для генетики в том, что с его использованием можно создавать новые гибриды растений, которые не удается получить половой гибридизацией. Благодаря этому методу удается преодолевать межвидовые и даже межродовые барьеры.

54. Цитогенетический метод. Диагностика хромосомных нарушений человека. Значение для медицины.
Основа метода — микроскопическое изучение хромосом человека. Цитогенетические исследования стали широко использоваться с начала 20-х гг. XX в. для изучения морфологии хромосом человека, подсчета хромосом, культи­вирования лейкоцитов для получения метафазных пластинок.

Развитие современной цитогенетики человека связано с именами цито­логов Д.Тио и А.Левана. В 1956 г. они первыми установили, что у человека 46 (а не 48, как думали раньше) хромо­сом, что положило начало широкому изучению митотических и мейотических хромосом человека.

В 1959 г. французские ученые Д. Лежен, Р.Тюрпен и М. Готье устано­вили хромосомную природу болезни Дауна. В последующие годы были описаны многие другие хромосомные синдромы, часто встречающиеся у че­ловека. Цитогенетика стала важней­шим разделом практической медици­ны. В настоящее время цитогенетиче­ский метод применяется для диагнос­тики хромосомных болезней, состав­ления генетических карт хромосом, изучения мутационного процесса и других проблем генетики человека.

В 1960 г. в г. Денвере (США) была разработана первая Международная классификация хромосом человека. В ее основу легли размеры хромосом и положение первичной перетяжки — центромеры

Все хромосомы по форме разделены на метацентрические, субметацентрические и акроцентрические и подразделены на 7 групп, обозначен­ных латинскими буквами А, В, С, D, Е, F и G. Каждая пара хромосом была на­делена порядковым номером от 1 до 22, выделены отдельно и поименованы латинскими буквами — X и Y половые хромосомы

В 1971 г. на IV Пражской конферен­ции генетиков в дополнении к Денвер­ской классификации были представле­ны методы дифференциальной окрас­ки хромосом, благодаря которым каж­дая хромосома приобретает свой непо­вторимый рисунок, что помогает точ­ной идентификации.

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изу­чении их в метафазах митоза и профазе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток, было достаточно высоко. Важнейшие цитогенетические работы выполнены на лимфоцитах периферической кро­ви, поскольку культивирование лим­фоцитов в течение 2-3 суток в присутствии фитогемагглютинина позволяет получить множество метафазных пла­стинок для хромосомного анализа.

Цитогенетическому анализу под­вергают однослойные метафазные пластинки с раздельно лежащими хро­мосомами

Для этого делящиеся клет­ки обрабатывают колхицином и неко­торыми другими химическими веще­ствами (гипотоническим раствором солей, метанол-уксусным фиксатором и др.).

Важным этапом цитогенетического анализа является окраска полученных препаратов. Ее проводят простыми, дифференциальными и флюоресцент­ными методами.

Простая окраска обеспечивает груп­повую идентификацию хромосом. Ис­пользуется она для количественного учета хромосомных аномалий при оп­ределении мутагенности среды (дейст­вия радиации, химических мутагенов и др.). С помощью этого типа окраски были открыты многие хромосомные болезни, а также хромосомные аберра­ции), вызывающие самопроизвольные аборты, врожденные пороки развития, канцерогенез и т.п.

В 70-е гг. XX в. в медицинской прак­тике начали применяться методы диф­ференциального окрашивания, выяв­ляющие структурную разнородность хромосом по длине, что выражается в виде чередования светлых и темных полос (эу- и гетерохроматических рай­онов). Отмечается, что протяженность и рисунок полос специфичны для каж­дой хромосомы.

Успехи молекулярной цитогенетики человека позволяют разрабатывать но­вые методы изучения хромосом. Так, следует отметить метод флюоресцент­ной гибридизации in situ (FISH), кото­рый дает возможность исследовать широкий круг вопросов: от локализа­ции гена до расшифровки сложных пе­рестроек между несколькими хромосо­мами. Метод FISH может применяться и для диагностики анеуплоидий в ин­терфазных ядрах (см. главу 6).

Таким образом, соединение цитогенетических и молекулярно-генетических методов в генетике человека де­лает почти неограниченными воз­можности диагностики хромосомных аномалий

Применяется для изучения кариотипа человека.
Метод включает:
1. Экспресс — диагностику Х — и У — хроматина — исследование полового Х — хроматина в ядрах клеток слизистой оболочки или в других клетках. В норме у женщин — 1 тельце Барра, у мужчин — нету. Половой У — хроматин определяется путем специального окрашивания и просмотра в люминесцентном микроскопе.
2. Кариотипирование — определение количества и строения хромосом с целью диагностики хромосомных болезней.

55. Биохимический метод. Значение для медицины.

Причиной многих врожденных на­рушений метаболизма являются различные дефекты ферментов, возника­ющие вследствие изменяющих их структуру мутаций. Биохимичские по­казатели (первичный продукт гена, на­копление патологических метаболитов внутри клетки и во всех клеточных жидкостях больного) более точно от­ражают сущность болезни по сравне­нию с показателями клиническими, поэтому их значение в диагностике на­следственных болезней постоянно воз­растает. Использование современных биохимических методов (электрофо­реза, хроматографии, спектроскопии и др.) позволяют определять любые ме­таболиты, специфические для кон­кретной наследственной болезни.

Предметом современной биохими­ческой диагностики являются специ­фические метаболиты, энзимопатии, различные белки.

Объектами биохимического анализа могут служить моча, пот, плазма и сы­воротка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты).

Для биохимической диагностики ис­пользуются как простые качественные реакции (например, хлорид железа для выявления фенилкетонурии или динитрофенилгидразин для выявления кетокислот), так и более точные методы

Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать нарушение обмена аминокислот, олигосахаридов, мукополисахаридов. Газовая хроматография применяется для выявления наруше­ний обмена органических кислот и т.д.

Показаниями для использования биохимических методов у больных с наследственным нарушением обмена веществ являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, желтуха, специфический запах мочи и пота, ос­тановка роста, нарушение физического развития, непереносимость некото­рых продуктов и лекарств.

Биохимические методы применя­ются и для диагностики гетерозигот­ных состояний у взрослых. Известно, что среди здоровых людей всегда име­ется большое число так называемых носителей патологического гена (ге­терозиготное носительство). Хотя та­кие люди внешне здоровы, вероят­ность появления заболевания у их ре­бенка всегда существует. В связи с этим, выявление гетерозиготного носительства — важная задача медицин­ской генетики.

Понятно, что если в брак вступают гетерозиготные носители какого-либо заболевания, то риск рождения боль­ного ребенка в такой семье составит 25%

Шансы на встречу двух носите­лей одинакового патологического гена выше, если в брак вступают родствен­ники, т.к. они могут унаследовать один и тот же рецессивный ген от своего об­щего предка.

Предположить гетерозиготное но­сительство у женщины можно, если:

— ее отец поражен наследственной болезнью;

— у женщины родились больные сы­новья;

— женщина имеет больного брата или братьев;

— у двух дочерей женщины роди­лись больные сыновья (или сын);

— у здоровых родителей родился больной сын, а у матери в родословной есть больные мужчины.

Выявление гетерозиготных носите­лей того или иного заболевания воз­можно путем использования биохими­ческих тестов (прием фенилаланина для выявления фенилкетонурии, при­ем сахара — сахарного диабета и.т.д.), микроскопического исследования кле­ток крови и тканей, определения активности фермента, измененного в ре­зультата мутации.

Известно, что заболевания, в основе которых лежит нарушение обмена ве­ществ, составляют значительную часть наследственной патологии (фенилкетонурия, галактоземия, алкаптонурия, альбинизм и др.). Так, гетерозиготные носители фенилкетонурии реагируют на введение фенилаланина более силь­ным повышением содержания амино­кислоты в плазме, чем нормальные го­мозиготы (болезнь обусловлена рецес­сивным аллелем).

Биохимический метод широко при­меняется в медико-генетическом кон­сультировании для определения риска рождения больного ребенка. Успехи в области биохимической генетики спо­собствуют более широкому внедре­нию диагностики гетерозиготного носительства в практику. Еще недавно можно было диагностировать не более 10-15 гетерозиготных состояний, в на­стоящее время — более 200. Однако следует отметить, что до сих пор име­ется немало наследственных заболева­ний, для которых методы гетерозигот­ной диагностики еще не разработаны.

56. Пренатальная диагностика хромосомных болезней. Амниоцентез. Медико — генетическое консультирование. Значение для медицины.
Пренатальная диагностика хромосомных заболеваний (ПД) — представляет собой комплекс врачебных мероприятий и диагностических методов, направленных на выявление морфологических, структурных, функциональных или молекулярных нарушений внутриутробного развития человека.
Методы:
1. Биопсия хорионов — может определить врожденные дефекты плода на очень ранних сроках беременности 9 -11 неделя. Проводится цитогенетическими, молекулярно — генетическими методами. Позволяет выявить синдром Тай-Сакса, серповидно-клеточную анемию, большинство видов муковисцидоза, талассемию и синдром Дауна.

2. Амниоцентез — инвазивная процедура, заключающаяся в пункции амниотической оболочки с целью получения околоплодных вод для последующего лабораторного исследования, амниоредукции или введения в амниотическую полость лекарственных средств. Амниоцентез можно выполнять в первом, втором и третьем триместрах беременности оптимально — в 16-20 недель беременности.

Показания к амниоцентезу:
Пренатальная диагностика врождённых и наследственных заболеваний. Лабораторная диагностика врождённых и наследственных заболеваний основана на цитогенетическом и молекулярном анализе амниоцитов.
Амниоредукция при многоводии.
Интраамниальное введение препаратов для прерывания беременности во втором триместре.
Оценка состояния плода во втором и третьем триместрах беременности степень тяжести гемолитической болезни, зрелость сурфактантов лёгких, диагностика внутриутробных инфекций.
Фетотерапия.
Фетохирургия.

3. Кордоцентез — метод получения кордовой пуповинной крови плода для дальнейшего исследования.
Обычно производится параллельно амниоцентезу взятию околоплодных вод. Производится не ранее 18 недель гестации.
Через переднюю брюшную стенку беременной после инфильтрационной анестезии под контролем ультразвукового аппарата производят прокол тонкой пункционной иглой, попадают в сосуд пуповины, получают до 5 мл. крови.
Метод применим для диагностики хромосомных и наследственных заболеваний, резус — конфликта, гемолитической болезни плода и т.д.

4. УЗИ.
Медико-генетическое консультирование — это система оказания специализированной медико-генетической помощи в виде неонатального скрининга на фенилкетонурию и врожденный гипотиреоз; собственно генетического консультирования семей, в которых отмечаются случаи врожденных и наследственных заболеваний ВНЗ; пренатальной диагностики состояния плода в случае следующей беременности, а также пренатального скрининга беременных исследования сывороточных материнских маркеров — альфа-фетопротеина АФП, хорионического гонадотропина ХГ, неэстерифицированного эстриола НЭ и других маркеров.

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...