 |
Санитарно-микробиологическое исследование почвы
|
|
|
|
Цель занятия. Ознакомить студентовс микрофлорой почвы, источниками ее загрязнения патогенной микрофлорой. Студенты должны овладеть различными методами бактериологического исследования почвы.
Материальное оснащение: образцы почвы в пакетиках по 1 г, стерильный физраствор по 9 мл в пробирках, стерильные пипетки по 1 мл, стерильные чашки Петри, расплавленный МПА в пробирках столбиком, пробирки со средой Кесслера, агар Эндо в чашках Петри.
Почва является естественной средой обитания многих видов микроорганизмов. В ней имеются все условия для благоприятного их развития: достаточное количество влаги, органических и минеральных веществ. Почвенные микроорганизмы участвуют в минерализации органических отбросов, самоочищении почвы, в круговороте веществ в природе.
В почву с выделениями больных, а также с трупами животных, погибших от инфекционных болезней, со сточными водами попадают патогенные микроорганизмы. В связи с этим почва может служить источником распространения возбудителей инфекционных болезней, через почву загрязняются объекты окружающей среды, может происходить обсеменение сапрофитными и болезнетворными микроорганизмами сырья животного происхождения, пищевых продуктов, кормов.
В составе микрофлоры почвы принято выделять так называемые физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах и на разных этапах постепенного разложения органических веществ, к которым относятся:
1. Аммонификаторы, являющиеся гнилостными микроорганизмами, вызывающими гниение остатков растений, трупов животных, разложение мочевины (Bac. subtilis, Bac.mesentericus, S.marcescens, Proteus, грибы рода Aspergillus, Penicillium; анаэробы - Cl.sporogenes Cl.perfringens).
|
|
|
2. Нитрифицирующие бактерии;
3. Азотфиксирующие – клубеньковые и свободноживущие азотфиксирующие бактерии обладают исключительной способностью усваивать из воздуха атмосферный азот и в процессе жизнедеятельности образуют из молекулярного азота белки и другие органические соединения азота, которые используются растениями.
4. Бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожения, наблюдаемые при разложении микробами органических соединений углерода (молочнокислое, спиртовое, масляное, уксусное, пропионовокислое, ацетонобутиловое и др.).
5. Бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора.
На сроки выживания патогенных бактерий в почве оказывают влияние многие факторы: тип почвы, температура, воздействие окружающий экологии.
К первой группе патогенных микроорганизмов относятся клостридии Cl.perfringens, Cl.botulinum, которые образуют споры и могут попасть с остатками земли в силосуемую массу.
Вторая группа включает спорообразующие патогенные микроорганизмы (возбудители сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены), почва для них является вторичным резервуаром, поскольку при благоприятных условиях они могут размножаться и сохраняться в почве длительное время в виде спор. Например, палочки сибирской язвы оказались способными вегетировать в почве при 120 С, достаточной влажности и наличии гумуса и микроэлементов.
В третью группу включены патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделениями животных и человека и сохраняющиеся там, в течение нескольких недель или месяцев. Все эти микроорганизмы – сальмонеллы, бруцеллы, микобактерии, лептоспиры и т.д. не образуют спор и поэтому быстро гибнут, в результате воздействия различных физических и химических факторов.
В почве обитает много плесневых грибов, некоторые из них, например, грибы из рода Фузариум, Стахиботрис, попадая на злаковые и другие растения, в процессе своего развития, вырабатывают токсические вещества, особенно во время зимовки на полях.
|
|
|
| Микробы, для которых почва является природным биотопом | Микробы, попадающие в почву с выделениями животных и человека | |
| Сохраняющиеся долго | Сохраняющиеся сравнительно недолго | |
| Клостридии ботулизма Возбудители глубоких микозов. Актиномицеты Некоторые возбудители Микотоксикозов. | Бациллы сибирской язвы. Клостридии столбняка. Клостридии анаэробных инфекций. | Сальмонеллы, шигеллы, вибрионы, бруцеллы. Возбудители туляремии, туберкулеза,лептоспироза. Возбудитель сапа, Вирус ящура, энтеровирусы. |
Обычно ограничиваются определением следующих показателей в почве:
- количество МАФАнМ в 1 г;
- коли-титра почвы;
- в отдельных случаях в почве определяют наличие возбудителей сибирской язвы (например, при строительстве детских лагерей, новых животноводческих помещений).
Отбор проб почвы. На обследуемой территории до 1000 м3 выделяют два участка по 25 м2 каждый: один участок выбирают вблизи, другой – вдали от источника загрязнения. С каждого участка отбирают среднюю пробу, составленную из 5 образцов, взятых по диагонали. Образцы берут на глубине до 20 см, при исследовании почвы скотомогильников – ниже глубины захоронения не менее чем на 25 см. Пробы отбирают стерильным железным совком или специальным буром в стерильные широкогорлые банки, которые закрывают ватными пробками. К банке приклеивают этикетку с датой и номером отобранной почвы.
Массакаждого образца должна быть 200-300 г, а смешанного – не менее 1 кг. Отобранные пробы почвы направляют в лабораторию и исследуют сразу же или не позднее, чем через 12-18 ч при хранении в холодильнике.
Определение МАФАнМ в 1 г почвы методом серийных разведений
Для приготовления первого разведения 1:10 в колбу емкостью 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды, куда добавляют 30 г исследуемой почвы. Колбу встряхивают несколько минут и отстаивают для оседания тяжелых частиц, микроорганизмы останутся в верхнем прозрачном слое.
Но в условиях учебного класса обычно 1 г почвы вносят в 10 мл стерильной воды, из полученного разведения почвы 1:10-1 готовят последующие десятикратные разведения: для чистых почв до 1:10-4, для загрязненных – до 1:10-6 - 1:10-9.
|
|
|
Из двух последних разведений почвы берут по 1 мл и переносят в стерильные чашки Петри (не менее двух чашек на каждое разведение), которые заливают 15 мл охлажденного до 500С МПА и тщательно перемешивают, (этот метод называется «метод горячих заливок»). Посевы культивируют в термостате 24-48 ч при 300С.
Учет результатов проводят путем подсчета выросших колоний в чашках Петри и определения среднеарифметического числа. Полученное число колоний умножают на степень разведения исследуемой почвы и получают число бактерий в 1 г почвы. Обычно в 1 г огородной почвы количество бактерий достигает 1-3 млрд.
Определение коли-титра почвы методом бродильных проб с использованием среды Кесслера. Исследования проводят в три этапа. На первом этапе готовят разведения: для чистых почв от 1:10-1 до 1:10-3; для загрязненных – от 1:10-3 до 1:10-9. После тщательного перемешивания полученной суспензии из различных разведений по 1 мл переносят в пробирки с 9 мл среды Кесслера с поплавками. Посевы культивируют при 430С в течение 48 часов (при такой температуре дает рост кишечная палочка только теплокровных).
На втором этапе исследования просматривают посевы на среде Кесслера. Из проросших пробирок с наличием газа делают высев на поверхность агара Эндо в чашках Петри по секторам (4), с таким расчетом, чтобы выросли изолированные колонии. Посевы культивируют при 370С в течение 24 ч.
На третьем этапе исследуют колонии, выросшие на среде Эндо. Для этого отмечают и отбирают колонии, типичные для бактерий БГКП, готовят из них мазки, красят по Граму, микроскопируют. При обнаружении в мазках коротких грамотрицательных палочек проводят высев из этих колоний на среду Кесслера для подтверждения газообразования в чистой культуре. В таблице 2 приведены санитарно-микробиологические показатели почвы.
Таблица 2
Микробиологические нормативы санитарного состояния почвы
| Оценка почвы | МАФАнМ, КОЕ, не более | Коли-титр почвы |
| Относительно чистая | Менее 10 тысяч | Выше 1,0 |
| Умеренно загрязненная | Сотни тысяч | 1,0 - 0,01 |
| Сильно загрязненная | Миллионы | 0,01 - 0,001 |
|
|
|
Особую трудность представляет выделение сибиреязвенных спор из почвы, так как в ней находится огромное количество различных микроорганизмов, в том числе спорообразующих сапрофитных аэробов (Bac.subtilis - сенная палочка, Bac.mesentericus - картофельная палочка, Bac. megatherium - капустная палочка) по многим своим свойствам схожих с палочкой сибирской язвы. Существующие бактериологические методы не всегда позволяют легко выделить возбудителя сибирской язвы из почвы. Основная трудность состоит в отделении спор от частиц почвы. Из многих известных методов более надежным является метод предварительной подготовки пробы почвы по следующей методике: 1.100 г исследуемой почвы заливают 5-10 кратным объемом стерильного фосфатного буфера или воды; 2. Шуттелируют взвесь в течение 20-30 мин, с последующим 5-8 мин отстаиванием; 3. Фильтрование через 2-3 слоя марли; 4. Прогревание полученной суспензии в водяной бане в течение 30 мин при 700С для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры; 5. Посев полученной суспензии в МПБ и на поверхность МПА в чашках Петри для получения изолированных колоний; 6.Заражение полученной культурой 5-10 белых мышей, подкожно в дозе 0,1-0,2 мл; 7. Вскрытие павших мышей и выделение чистой культуры возбудителя сибирской язвы.
Для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы из исследуемого материала загрязненного посторонней микрофлорой, предложены селективные среды, в состав которых вводят 200-500 ЕД/мл полимиксина в сочетании с триметопримом, которые подавляют рост сопутствующей микрофлоры: мезофильных бактерий, B.subtilis, B.cereus и E.coli.
|
|
|
