 |
Выделение чистой культуры аэробных бактерий
|
|
|
|
В условиях естественного обитания чистые культуры микроорганизмов встречаются довольно редко. Тем не менее, основная часть современных представлений о свойствах бактерий, а также их взаимоотношениях получена при изучении чистых культур. Поэтому совершенно необходимой задачей является выделение чистых культур различных видов бактерий, существующих в естественных условиях. Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2-3 суток, однако для некоторых (например, бактерии туберкулеза), этот процесс может затягиваться до 4 - 6 недель. Чистой культурой микроорганизмов называют популяцию бактерий одного вида, представляющую потомство одной клетки.
Методы, применяемые для выделения чистой культуры:
1) Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов:
а) механическое разобщение бактериальных клеток на поверхности плотных питательных сред шпателем (по Дригальскому), рассев штрихами калиброванной петлей (по Гольду) или тампоном после забора им исследуемого материала;
б) метод фильтрации, основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделение содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).
2) Метод, основанный на получении серийных разведении в жидкой среде с последующим высевом на чашки с агаром (метод пластинчатых разводок по Коху).
3) Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов:
а) избирательном подавлении размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре для получения культур психрофильных бактерий;
|
|
|
б) метод Шукевича: клетки бактерий (протея), характеризующиеся скользящим типом движения, засеянные в конденсационную жидкость свежеприготовленного скошенного агара, поднимаются («всползают») по поверхности среды и разрастаются далеко за зону внесения посевного материала;
в) метод прогревания: позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. (При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают);
г) бактериостатический метод (метод ингибирования): основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы - определенные вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие, например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные, смесь пенициллина и стрептомицина позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры, серная кислота (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях;
д) метод заражения лабораторных животных или растений: основан на способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопроба); применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры; для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений, после появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным.
|
|
|
Методы культивирования облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий, хламидий) и вирусов
Для культивирования вирусов (так же, как и для других облигатных паразитов - риккетсий и хламидий) используют куриные эмбрионы, культуры тканей и лабораторных животных.
Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов в целях получения вирусов и для приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов - диагностикумов и вакцин. Куриные зародыши используют в возрасте от 8 до 12 дней, перед заражением инфекционным материалом скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают, смазывают йодом (2% настойка), вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал, обработанный для удаления бактериальной флоры, в асептических условиях наносят на хорион-аллантоисную оболочку или вводят в желточный мешок, аллантоисную полость, либо в амнион (ткань эмбриона). После заражения в аллантоисную полость через отверстие заливают парафин;
если материалом заражают хорион-аллантоис, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином. После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С. Признаки репродукции вируса проявляются особенно четко в месте заражения на хорион-аллантоисной оболочке в виде очагов поражения и геморрагий или для его обнаружения применяют специальные реакции (например, реакцию гемагглютинации - РГА).
Культуры клеток (тканей) получают из тканей животных и человека. Их делят на первичные, которые используют в течение одной генерации, и перевиваемые, которые поддерживают путем пассажей (перевивок) длительное время. Клетки перевиваемой культуры ткани готовят из нормальных (чаще эмбриональных) и злокачественных линий клеток, они способны сравнительно прочно прикрепляться к стеклу флакона, образовывать монослой клеток и многократно размножаться in vitro. Для поддержания жизнеспособности клеток применяются специальные синтетические среды (например, среда 199, среда Хэнкса), содержащие аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли с добавлением 5 -10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток. Репродукция вирусов в культуре клеток сопровождается так называемым цитопатическим действием (ЦПД), которое проявляется в изменении морфологии клеток и их гибели или образования синцития, а в некоторых случаях - в возникновении в инфицированных клетках клеточных включений. Характер и время проявления ЦПД зависит от вида вируса.
|
|
|
Для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделения вирусов используют лабораторных животных (белых мышей, хомяков, крыс, кроликов и др.). Чувствительность животных к вирусам зависит от вида животного и его возраста.
Культивирование риккетсий
Риккетсии являются облигатными паразитами, их культивирование возможно только в живых тканях. Обычно их выращивают в желточном мешке куриного эмбриона.
Культивирование хламидий
Хламидии можно размножать в желточном мешке куриного эмбриона или в культурах тканей позвоночных. Размножение в куриных эмбрионах происходит в температурных границах 33 - 41°С и даже более широких, но чувствительность к обеим крайним температурам и оптимум для роста варьирует от вида к виду.
Цели занятия:
1. Изучить принципы классификации питательных сред, методы выявления культуральных свойств бактерий на различных питательных средах и вирусов в различных условиях культивирования.
2. Освоить технику посевов бактерий на плотные и жидкие питательные среды.
3. Начать освоение методики выделения чистых культур аэробов.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Метаболизм микроорганизмов.
2. Источники углерода, азота, макро- и микроэлементов, ростовых факторов для микробов. Аутотрофы и гетеротрофы. Фототрофы и хемотрофы.
3.Питательные среды. Механизм переноса питательных веществ в бактериальную клетку
4. Определение понятий: культура, штамм, клон. Колонии, особенности их формирования у различных видов бактерий.
5.Принципы культивирования различных групп микроорганизмов.
Культуральные свойства бактерий.
6. Механизм и скорость размножения микроорганизмов. Фазы размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде в стационарных условиях. Образование микробами пигментов, токсинов, витаминов, аминокислот, полисахаридов и других веществ.
7. Особенности роста и размножения риккетсий, хламидий и вирусов.
8. Методы культивирования бактерий, в том числе облигатных внутриклеточных: (риккетсий, хламидий) и вирусов.
Уметь:
1. Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные питательные среды.
2. Описать культуральные свойства микроорганизмов.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
|
|
|
