 |
Выделение чистых культур бактерий по методу Дригальского.
|
|
|
|
Берут 3 чашки Петри с питательной средой. В одну из чашек на питательный агар пастеровской пипеткой или петлей наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев, после чего чашки помещаются в термостат. В последующем, в извлеченных из термостата чашках в зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии различных бактерий, отличающиеся между собой по форме, цвету, величине, консистенции, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма. Отдельную (изолированную) "подозрительную", интересующую исследователя колонию снимают и засевают на скошенный агар. Из остатка колонии готовят микропрепарат и изучают при окраске по Граму. У выросших на скошенном агаре бактерий (как правило, одного вида) определяют биохимические, тинкториальные, антигенные свойства и делают заключение о выделенной культуре бактерий.
При выделении чистой культуры бактерий по Гольду, внесенной на один из 4-х секторов пластинчатого агара в чашке Петри, материал равномерно штрихами засевается по всему сектору и петля прожигается. Охлажденной петлей материал снимается с одного из штрихов первого сектора и переносится во второй, где производится равномерный штриховой посев, аналогичный первому. В третий и четвертый сектор посев делается соответственно из второго и третьего секторов аналогично засеву второго сектора.
После инкубации в термостате наиболее густой рост бактерий выявляется в области первых штрихов первого сектора. В каждом последующем секторе выявляется менее густой рост бактерий, чем в предыдущем, или рост отдельных колоний. Отдельную колонию отвивают на скошенный агар и идентифицируют по тинкториальным, биохимическим, серологическим свойствам.
|
|
|
Данный метод применяется в тех случаях, когда одновременно с выделением чистой культуры необходимо определить количество бактерий в исследуемом материале. Определение количества бактерий всех видов в 1 г (1 мл) материала производят по числу выросших на соответствующей среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения. Количество микроорганизмов в 1,0 г = n'а'b', где n - число колоний, выросших на питательной среде; а - коэффициент посевной дозы (при посеве 0,1 мл а=10, при посеве 0,05 мл а=20); b - степень разведения посевного материала.
Метод серийных разведений (пластинчатых разводок) по Коху также применяет для определения количества микробов в исследуемом материале, чаще всего в жидких средах.
Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Агар-агар, пептон в порошке, МПБ, МПА, сывороточные среды, желчный бульон, сахарный бульон, кровяной агар, среды Гиса, Эндо, Левина, Клиглера, среды обогащения (магниевая, селенитовая), среда 199.
2. Демонстрация всех вариантов посевов и пересевов бактерий: со скошенного агара на скошенный, со скошенного агара на бульон, с бульона на бульон с помощью петли и пастеровской пипетки.
3. Демонстрация методов посева для выделения чистых культур по Дригальскому и Гольду.
|
|
|
4. Клеточные культуры, чистые и зараженные вирусами.
5. Схемы строения куриного эмбриона.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Каждый студент производит пересев со скошенного агара на скошенный.
2. Пересев со скошенного агара на бульон петлей и пастеровской пипеткой (два студента в бригаде).
3. Две бригады студентов из 3-4 человек производят посев взвеси испражнений шпателем по Дригальскому на чашки со средами Эндо и Плоскирева. Две бригады студентов проводят посев слизи из зева в чашки Петри со средой ЖСА.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Каковы основные фазы роста бактериальной популяции в жидкой
питательной среде?
2. Каковы механизмы поступления питательных элементов в бактериальную клетку?
3. Каким требованиям должны отвечать питательные среды?
4. Какие среды называются элективными, дифференциально-диагностическими, универсальными? Примеры.
5. Что такое чистая культура бактерий?
6. В чем сущность бактериологического метода выделения чистой культуры?
7. В чем сущность биолого-бактериологического метода выделения
чистой культуры?
8. Что представляет собой колония бактерий на питательной среде?
9. В чем заключаются культуральные различия разных видов бактерий?
10. В чем заключаются особенности культивирования облигатных внутриклеточных бактерий и вирусов?
11. Назовите методы культивирования хламидий, риккетсий и вирусов?
12. Как проводится индикация ростахламидий, риккетсий и вирусов при их культивировании?
13. Для каких целей применяется метод посева исследуемого материала по Гольду?
ЗАНЯТИЕ №6
Темы:
• Методы выделения чистых культур аэробных бактерий (продолжение).
•Основные типы биологического окисления субстрата (аэробный и анаэробный).
• Действие физико-химических факторов на микроорганизмы. Асептика и антисептика.
План занятия:
1. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (2-й день). Идентификация: культуральные, морфологические и тинкториальные свойства.
2. Методы культивирования анаэробных бактерий.
3. Методы выделения и идентификации чистых культур анаэробных бактерий.
4. Методы стерилизации. Дезинфекция.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Выделяя чистую культуру микроорганизма, следует обращать внимание на характер роста микроба, т.е. на культуральные особенности как на один из признаков, позволяющий идентифицировать род, вид микроорганизма. При культивировании микроба на жидких средах, можно видеть рост бактерий в виде:
|
|
|
а) диффузного помутнения;
б) придонного и пристеночного роста в прозрачной среде;
в) поверхностной пленки;
г) «комочка ваты».
В полужидких средах можно наблюдать:
а) диффузный рост вокруг посева уколом (подвижныебактерии );
б) рост по ходу укола (неподвижные бактерии);
в) разрыв среды или образование пузырьков газа.
На плотных средах наблюдается:
а) рост отдельными колониями;
б) рост сплошным налетом.
Определение чистоты выделенной культуры
Изолированные колонии, выросшие на плотной среде, отсевают бактериальная петлей на поверхность скошенной агаризованной среды в пробирке. Поскольку изолированные колонии иногда могут формироваться не только из отдельных клеток, обязательным этапом выделения чистой культуры должна быть проверка их однородности. Это осуществляется несколькими способами: визуальным, микроскопическим и высевом на соответствующие питательные среды. При визуальном контроле исследуют рост культуры по штриху на поверхности скошенной среды; в том случае, если рост неоднороден, считают, что культура загрязнена и требуется ее дополнительная расчистка.
При описании колоний бактерий определяют их диаметр в миллиметрах, пигментацию, форму (точечная, круглая, волокнистая, неправильная, ризоидная), высоту, профиль (плоский, высокий, выпуклый), вид края. Край колонии может быть ровным, волнистым, лопастным, зубчатым, волокнистым, складчатым и т. д. Для рассмотрения краев используют микроскоп с малым увеличением. Следует описать также и поверхность колоний, которая бывает гладкой, блестящей, шероховатой, тусклой, неровной, гранулированной матовой, мукоидной, слизистой. Отмечают степень прозрачности колоний (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные) и их консистенцию при проверке иглой: маслянистую, вязкую, сухую. На характеристики колоний могут влиять среда, возраст культуры, условия культивирования.
|
|
|
Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контролировать путем микроскопии клеток. Для этого готовят препарат фиксированных окрашенных клеток, который микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки чистых культур микроорганизмов, как правило, однородны по размеру и окраске по Граму. Однако, следует помнить, что колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах многих бактерий могут появляться кокковидные клетки, цисты, споры. Наконец, многие микроорганизмы проявляют грам-вариабельность.
Чистоту культуры клеток проверяют также и путем повторного рассева на селективные среды, обеспечивающие избирательный рост тех или иных микроорганизмов. Критерием чистоты в этом случае является однородность формирующихся при этом колоний.
|
|
|
