 |
Реакция радиального гемолиза в геле.
|
|
|
|
Реакция радиального гемолиза в геле - это вариант реакции гемолиза и РСК в геле. Эту реакцию ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза. Таким образом, можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки. Если в гель добавить эритроциты, на которых адсорбированы антигены различных возбудителей (вирусов гриппа, краснухи и т.д.), а в лунки вносить сыворотки больных, то антитела сыворотки взаимодействуют с вирусными антигенами на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяется комплемент и наступает гемолиз в агаре.
Реакция локального гемолиза в геле предложена Н.Йерне (1963 г.) - ее применяют для подсчета клеток - антителопродуцентов.
Клетки, продуцирующие антитела (например, плазмоциты селезенки, после иммунизации животного эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей антитела к эритроцитам барана. Метод получил распространение во многих областях экспериментальной иммунологии, т.к. дает возможность оценить образование антител на уровне отдельных тканей и клеточных популяций иммунной системы после различных воздействий.
Реакции с применением меченых антител и антигенов -составляют основу современных методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, благодаря высокой чувствительности этих методов, позволяющих определять минимальные количества антигенов (антител) в исследуемом материале (нанограммы).
|
|
|
Иммуноферментный метод (анализ) - ИФА - выявление антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой, вгалактозидазой или щелочной фосфатазой).
Наиболее распространен твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например, в лунках полистироловой планшеты. Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках планшеты, затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (обычно пероксидазой). После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (орто - фенилдиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. По изменению цвета и интенсивности окраски раствора судят о наличии и количестве антител. Если необходимо определить в исследуемом материале антиген, тогда в лунку с сорбированными антителами вносят исследуемый материал, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченую ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Измерение количества продуктов реакции ИФА проводится в автоматизированном варианте в приборах - ридерах с помощью спектрофотометра или автоматических ридерах, измеряя оптическую плотность растворов в лунках при определенной длине волны.
К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики ИФА: конкурентные методы ИФА, сэндвич-ИФА (метод Двойных антител для определения антигена) и др. Для постановки ИФА выпускаются специальные тест-системы с набором всех необходимых ингредиентов.
Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили широкое распространение в различных областях биологии и медицины. ИФА используется для определения антигенов или антител при различных бактериальных, вирусных и протозойных инфекциях, в частности при диагностике ВИЧ-инфекции. ИФА применяется также для
|
|
|
определения концентрации лекарственных препаратов, гормонов,цитокинов в организме, присутствия в нем раковых клеток, гельминтов.
Иммуноблотинг (от англ. "blot" - пятно) - метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель - электрофореза с ИФА.
Первоначально методом электрофореза выделяют все антигены вируса и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной пленке.
При постановке иммуноблотинга на пленку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА - на пленку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело, на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблотинга позволяет обнаружить антитела одновременно на все антигены возбудителя. Поэтому его проводят часто для подтверждения предполагаемого диагноза (например, при ВИЧ инфекции), выставленного на основании положительной реакции обычной ИФА (т.е. с каким-либо одним антигеном), что позволяет избежать диагностических ошибок из-за случайных совпадений.
Радиоиммунный анализ (РИА)
Принцип радиоиммунного анализа (РИА) основан на выявлении комплекса АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода (125J или131J). Учет реакции проводят с помощью специальных счетчиков ß или γ-излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопаснось работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.
Кожные пробы
Для определения гиперчувствительности (аллергии) к антигенам-аллергенам у людей проводят провокационные тесты. Суть их в том, что соответствующий аллерген вводят в организм, чаще всего внутрикожно или накожно. Иногда сублингвально, ингаляционно или в конъюнктиву глаза. Обычно спустя 30 минут оценивают немедленные аллергические реакции, через 24 - 48 часов - замедленные.
|
|
|
На пыльцевые, пищевые, лекарственные аллергены чаще наблюдаются немедленные кожные (сублингвальные, конъюнктивальные) реакции в виде покраснения и припухлости. С помощью этих реакций можно установить природу аллергена, вызвавшего аллергическое заболевание. Поскольку гетерологичные сывороточные белки при повторном введении могут стать причиной развития анафилактического шока, в основе которого также лежит аллергия немедленного типа, перед введением такого рода иммунных препаратов для выявления аллергии, а вместе с тем для временной десенсибилизации ставится кожная проба с соответствующим аллергеном.
Реакции замедленной гиперчувствительности развиваются обычно на бактериальные антигены. Поскольку это является результатом ин-фицированности организма, такого рода кожные реакции можно использовать как один из методов диагностики инфекционных заболеваний (туберкулез, туляремия, бруцеллез и др.) и оценки эффективности вакцинации живой противотуберкулезной вакциной. Во всех этих случаях в качестве аллергена используется вытяжка из соответствующих микробов (туберкулин, тулярин, бруцеллин и т.д.). Например, для выявления сенсибилизации к микобактериям туберкулеза чаще всего ставится кожно-аллергическая проба Манту, когда туберкулин РРО вводится внутрикожно.
Для оценки иммунитета против дифтерии используют кожную им-мунобиологическую пробу Шика, а для скарлатины - Дика. В этих пробах используют экзотоксины соответствующих микробов. Реакции основаны на нейтрализации токсина антитоксинами in vivo. При наличии у испытуемого антител они нейтрализуют токсин в коже, поэтому гиперемии не будет (реакция отрицательная). Наоборот, при отсутствии антител, экзотоксин вызывает гиперемию (реакция положительная).
|
|
|
Цели занятия:
1. Изучить принципы и методы постановки реакций лизиса,РСКи твердофазных реакций ИФА, иммуноблотинга и РИА.
2. Изучить принципы и методы постановки кожно-аллергических и кожных иммунобиологических проб и механизм их развития.
3. Уметь интерпретировать результаты серологических исследований и кожных проб.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Диагностические реакции антиген-антитело: РСК, ИФА, РИА, иммуноблотинг.
2. Кожно-аллергические реакции для выявления гиперчувствительности немедленного и замедленного типа, кожные иммунобиологичекие реакции для определения антитоксического иммунитета.
Уметь:
1. Оценить результаты постановки РСК, ИФА,кожно-аллергических и иммуно - биологических кожных реакций.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Реакция титрования гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, полученная путем иммунизации кролика эритроцитами барана, перед титрованием разводится (см. схему разведения гемолитической сыворотки). Для постановки опыта титрования гемолитической сыворотки 0,5 мл каждого разведения сыворотки необходимо соединить с 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана (антиген) и 0,5 мл комплемента (свежая сыворотка морской свинки в разведении 1:10). Реакция идет в термостате при 37°С в течение 40 - 60 мин (см. схему титрования гемолитической сыворотки).
Титром гемолитической сыворотки называется то наибольшее ее разведение, которое в количестве 0,5 мл в присутствии 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, растворяет 0,5 мл 3 % взвеси эритроцитов барана в течение 1 часа пребывания в термостате при 37°С. Титр гемолитической сыворотки должен быть не ниже 1:1200.
Титрование комплемента (см. схему) необходимо для определения титра и рабочей дозы комплемента. Для титрования комплемента используется реакция гемолиза. Донорами комплемента являются морские свинки, сыворотка которых разводится 1:5 и используется для установления титра комплемента (разведения от 1:10 до 1:40), к которому добавляется гемолитическая система.
Гемолитическая система состоит из прогретой гемолитической сыворотки, взятой в тройном титре (антитело), и 3 % взвеси эритроцитов (антиген), взятых в равных соотношениях.
Реакция ставится в термостат на 40 мин при t 37°С. Учет реакции проводится по наличию или отсутствию гемолиза (лаковой крови).
Титром комплемента называется его минимальное количество (максимальное разведение), при котором еще происходит гемолиз. Для постановки РСК комплемент берут в рабочей дозе - титр увеличенный на 20-25%.
Постановка основного опыта реакции связывания комплемента (см. схему №4).
|
|
|
Постановке реакции предшествует подготовка всех ингредиентов, так как для постановки РСК они берутся в строго определенных соотношениях.
В качестве антигена используются растворенные антигены бактерий, риккетсий, антигены вирусов, грибов и др. Антигены могут обладать антикомплементарным действием (т.е. способностью инактивировать комплемент), поэтому антиген титруется перед постановкой РСК с помощью реакции гемолиза. Титром антигена считается наибольшая доза его, которая не проявляет антикомплементарного действия, т.е. при которой прекращается задержка гемолиза. Для РСК используют рабочую дозу антигена, которая равна 1/2 его титра.
Исследуемая сыворотка (антитело) инактивируется при 56°С в течение 30 мин. для уничтожения в ней собственного комплемента.
Комплемент титруется и определяется его рабочая доза (см. выше).
Эритроциты барана и гемолитическая сыворотка смешиваются в равных объемах (гемолитическая система), при этом инактивированная гемолитическая сыворотка берется в тройном титре.
Подготовленные ингредиенты реакции делят на две системы: тест-систему (антиген, антитело, комплемент) и индикаторную систему (гемолитическая система). Сначала реакцию ставят в тест-системе (см. схему опыта) и инкубируют ее в термостате t=37°С в течение 45 мин, затем в реакцию вводят индикаторную систему
Если в исследуемой сыворотке содержатся специфические антитела на известный антиген, то образуется комплекс антиген-антитело, на котором адсорбируется комплемент, и гемолиза не произойдет (реакция положительная, гемолитическая система остается мутной). Если в сыворотке нет специфических антител, комплекс антиген-антитело не образуется, комплемент останется свободным после первой фазы реакции и адсорбируется комплексом эритроциты-гемолизины, в результате наступит растворение эритроцитов - гемолиз (РСК отрицательная).
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Реакция иммунного гемолиза: титрование гемолитической сыворотки.
2.Титрование комплемента, определение рабочей дозы комплемента.
3. Гемолитическая система.
4. РСК (основной опыт). Положительный и отрицательный результат.
5. Препараты: комплемент, гемолитическая сыворотка, антигены для
постановки РСК.
6. Тест-системы для постановкиИФА.
7. Тест-системы для постановки иммуноблотинга.
8. Таблицы, схемы, рисунки.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Постановка основного опыта РСК с исследуемыми сыворотками (первая и вторая фазы реакции).
2. Учёт результатов РСК, схему и результаты РСК записать в тетрадь.
Схема № 1. Разведение гемолитической сыворотки
| №№ пробирок | |||||||
| гемолитическая сыворотка в разведении 1:100(мл) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| физ.раствор (мл) | 0.9 | 1,1 | 1,4 | 1,7 | 1.9 | 2,4 | 2.9 |
| полученное разведение сыворотки | 1/1000 | 1/1200 | 1/1500 | 1/1800 | 1/2000 | 1/1500 | 1/3000 |
Схема № 2. Титрование гемолитической сыворотки
| №№ пробирок | Гемолитическая сыворотка (мл) из соответствующего разведения | 3% взвесь эритроцитов | комплемент в разведении 1:10(мл) | физ. раствор (мл) | Возможный результат |
| 0,5 1/1000 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | полный гемолиз | |
| 0,5 1/1200 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | полный гемолиз | |
| 0,5 1/1500 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | полный гемолиз | |
| 0,5 1/1800 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | неполный гемолиз | |
| 0,5 1/2000 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | нет гемолиза | |
| 0,5 1/2500 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | нет гемолиза | |
| 0,5 1/3000 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | нет гемолиза | |
| контроль | 0,5 | 0,5 | 1,0 | нет гемолиза |
В термостат 37°С на 40 мин
Схема № 3. Титрование комплемента
| №№ пробирок ингредиенты | ||||||||
| комплемент в разв. 1:5 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | - |
| изотонический раствор | 0,3 | 0,4 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,2 |
| количество смеси, удаляемой из проб | 0,4 | 0,4 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | - |
| получаемые разведения комплемента | 1:10 | 1:15 | 1:20 | 1:25 | 1:30 | 1:35 | 1:40 | - |
| гемолитическая система | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
В термостат 37°С на 30 мин
Схема № 4. Основной опыт реакции связывания комплемента
| О | К | К | К | К | К | К | |
| №№ пробирок ингредиенты (в мл) | |||||||
| исследуемая сыворотка в разв.1:5 | 0,2 | - | - | 0,2 | - | - | - |
| положительная сыворотка (контроль) | - | 0,2 | - | - | - | - | - |
| отрицательная сыворотка (контроль) | - | - | 0,2 | - | - | - | - |
| антиген | 0,2 | 0,2 | 0,2 | - | 0,2 | - | - |
| изотонич.р-р хлорида натрия | - | - | - | 0,2 | 0,2 | 0,4 | 0,6 |
| комплемент в рабочей дозе | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | - |
| Инкубация на холоде при 0-4°С в течение 18-24 ч или при 37°С в течение 30 мин | |||||||
| гемолитическая система | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| Инкубация при 37°С в течение 30 мин | |||||||
| результат |
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Реакции иммунного лизиса, разновидности, механизм.
2. Комплемент, его компоненты. Участие в иммунологических реакциях. Активация комплемента по классическому типу
3. Реакции бактериолиза, их биологическая роль, практическое значение.
4. Реакция иммунного гемолиза. Практическое значение.
5. Реакция связывания комплемента (РСК); системы, участвующие в реакции, ингредиенты. Механизм РСК.
6. Подготовка всех ингредиентов для РСК: а) титрование комплемента и установление его рабочей дозы; б) титрование гемолитической сыворотки; в) приготовление гемолитической системы; г) инактивация исследуемой сыворотки; д) титрование антигена.
7. Схема постановки основного опыта РСК. Положительный и отрицательный результат РСК. Практическое применение РСК.
8. Каков принцип постановки твердофазных диагностических иммунологических реакций?
9. Как поставить и учесть результаты ИФА и РИА?
10. Что такое иммуноблотинг, в каких случаях проводится это исследование?
11. Как определить природу аллергена, вызвавшего аллергическое заболевание, в основе которого лежит гиперчувствительности немедленного типа?
12. Каков механизм инфекционной аллергии, в основе которой лежит гиперчувствительности замедленного типа?
13. Как можно выявить инфекционную аллергию и с какойцелью проводят ее определение?
14. В каких случаях проводят кожныеиммунобиологические реакции(Дика и Шика), о чем свидетельствуютположительные реакции в этих случаях, каков их механизм?
ЗАНЯТИЕ №15
Темы:
• Иммунный статус организма человека.
• Иммунопрофилактика и иммунотерапия болезней человека .
План занятия:
1. Иммунный статус человека и его значение.
2. Тесты для оценки иммунного статуса и методы их определения.
3. Имунобиологические препараты: их классификация, области применения:
• вакцины, анатоксины, фаги, эубиотики;
• иммуноглобулины и иммунные сыворотки;
• иммуномодуляторы для иммунокоррекции: эндогенные (интер-лейкины, интерфероны, гормоны тимуса, миелопептиды и др.) и экзогенные (левамизол, адъюванты, циклоспорин, синтетич. и др.).
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Иммунный статус - это структурное и функциональное состояние иммунной системы человека, определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей. На состояние иммунной системы влияют возрастные, климатогеографические, социальные, экологические и многие другие факторы. "Биологические часы" иммунной системы - это тимус, инволюция которого с возрастом приводит к угасанию Т-клеточных реакций.
Иммунный статус можно объективно оценить путем постановки комплекса лабораторных тестов. Для оценки состояния доиммунных факторов неспецифической защиты определяют:
• фагоцитарные показатели;
• состояние системы белков комплемента;
• содержание белков острой фазы и цитокинов (интерферона, интерлейкина).
Для изучения лимфоцитарного иммунитета, в частности его гуморального звена, определяют:
1. Количество В-лимфоцитов в периферической крови и их бласттранс- формацию под действием поликлональных мутогенов (например, LPS).
2. Содержание иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови.
3. Титры специфических антител и катаболизм иммуноглобулинов.
Для оценки состояния клеточного звена специфического иммунитета определяют:
• количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций в периферической крови;
• функциональную активность Т-клеток под действием Т-митогенов (р.бласттрансформации под действием конканавалина А и/или фи-тогемагглютинина);
• содержание гормонов тимуса;
• уровень секретируемых цитокинов;
• состояние ГЗТ с различными аллергенами.
В зависимости от результатов исследования все эти тесты выполняются в определенной последовательности, а поэтому подразделяются на 2 уровня.
Тесты 1-го уровня:
• определение количества и морфологии лимфоцитов периферической крови
• определение Т- и В-лимфоцитов по СД рецепторам или в реакции Е-РОК и ЕАС-РОК
• определение сывороточных Ig
• определение фагоцитарной активности лейкоцитов
• кожные тесты
• рентгенография, рентгеноскопия лимфоидных органов Эти тесты определяются в любой клинико-иммунологической лаборатории и достаточны для первичного выявления лиц с иммунопатологией.
Тесты 2-го уровня:
• гистохимический анализ лимфоидных органов
• анализ СО-маркеров различных субпопуляций лимфоцитов с использованием моноклональных антител
• бласттрансформация Т- и В-клеток
• определение цитотоксичности лимфоцитов
• определение активности ферментов, ассоциированных с ИД
• определение синтеза и секреции цитокинов
• определение гормонов тимуса
• анализ респираторного взрыва фагоцитов
• определение компонентов комплемента
• анализ смешанных клеточных культур лимфоцитов Иммунодефициты - это нарушения нормального иммунного статуса, обусловленные дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа. В случае выявления отклонений от нормы показателей иммунного статуса назначают иммунокоррегирующую терапию.
Иммунобиологпческпе препараты:
Вакцины - препараты для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний.
В качестве действующего начала в вакцинах используют:
•живые, ослабленные микроорганизмы (бактерии, вирусы);
• инактивированные микробные клетки;
• отдельные антигенные компоненты бактерий и вирусов (протективные антигены);
• вторичные, продуцируемые микробными клетками метаболиты, например токсины и их обезвреженные дериваты - анатоксины;
• полученные химическим синтезом молекулярные антигены микробов, вирусов;
• полученные генно-инженерным способом антигены микроорганизмов, вирусов.
Аттенуированные живые вакцины: содержат аттенуированные штаммы бактерий, вирусов (т.е. штаммы с пониженной вирулентностью, но сохранившие антигенные свойства). Их получают путем воздействия на патогенные штаммы неблагоприятных для микробов факторов: химических (ингибиторы роста), физических (температура, радиация), биологических (пассажи через организмы животных, культуры клеток, куриные эмбрионы). Примеры: туляремийная, сибиреязвенная, чумная, бруцеллезная, гриппозная, коревая, полиомиелитная, паротитная вакцины.
Дивергентные живые вакцины: созданы на основе природных штаммов микроорганизмов, имеющих общую антигенность с возбудителем. Примеры: оспенная вакцина (вирус коровьей оспы), ВСО (вакцина содержит возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота).
Живые рекомбинантные вакцины (векторные): при создании таких вакцин используют непатогенные микроорганизмы (кишечная палочка, вирус осповакцины, дрожжи), в геном которых встроены гены патогенных микробов, отвечающие за синтез протективных антигенов. Пример: дрожжевая вакцина против гепатита В.
Убитые вакцины содержат культуру бактерий или вирусов, убитых тем или иным способом (нагревание, действие УФ-лучей, ионизирующей, радиации, обработка формалином, спиртом, фенолом). В результате инактивации бактерии и вирусы теряют жизнеспособность, но сохраняют антигенные и иммуногенные свойства.
Корпускулярные вакцины состоят из инактивированных цельных клеток бактерий (цельноклеточные) или состоят из вирионов (цельновирионные). Примеры; цельноклеточные вакцины-коклюшная, холерная моновакцина, брюшнотифозная; цельновирионные - вакцины против гриппа, бешенства, клещевого энцефалита, герпеса. Субклеточные, субви-рионные, молекулярные вакцины состоят из отдельных структурных элементов микробов или вирусов, несущих специфические протективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины): менингококковая, гриппозные (Ваксигрипп, Гриппол). Для вирусных вакцин такого рода часто применяют термин «расщепленные вакцины».
В последние 20 лет в России ведутся работы по созданию принципиально новых вакцинирующих препаратов контролируемого содержания. В их основе определенные высокоочищенные антигены, в том числе синтетические или рекомбинантные аналоги протективных антигенов возбудителей. Приоритетность и оригинальность этих работ заключается в том, что одновременно для целевых антигенов создаются полимерные молекулы-носители, позволяющие значительно повысить иммунный ответу индивидуумов с генетически обусловленной слабовыраженной реактивностью.
Анатоксины - препараты, получаемые из экзотоксинов микробов, путем их обезвреживания (дифтерийный, столбнячный, стафилококковый). Следовательно, чтобы получить анатоксин необходимо: культивировать микроорганизмы на жидкой питательной среде, отделить микробные клетки от экзотоксинов методом фильтрования и добавить к фильтрату формальдегид 0,4%-ной концентрации для обезвреживания). Обезвреживание происходит при температуре 37°С - 40°С в течение 4 недель. При таком режиме полностью утрачивается токсичность, но сохраняются антигенные и иммуногенные свойства токсинов. Анатоксин подвергают очистке от балластных веществ. Анатоксины дозируют в антигенных или имуногенных единицах (ЕС-единицы связывания или Lf - единицы флокуляции). К очищенному анатоксину для усиления его иммуногенных свойств добавляют адъювант.
Адъюванты - (adjuvant - помощник) - это группа веществ, повышающих иммуногенные свойства вакцин и анатоксинов. В качестве адъювантов используют различные по природе и физико-химическим свойствам вещества: гель гидрата окиси или фосфата алюминия, липиды, эмульгаторы, полимерные соединения, полисахариды бактерий или сами убитые бактерии (полный адъювант Фрейнда - взвесь убитых микобактерий в минеральном масле), сапонины и др.
Механизм действия адъювантов:
• создание "депо" антигена в месте введения препарата, в результате чего пролонгируется действие антигена на иммунную систему организма;
• усиление воспалительной реакции и активизация иммунокомпетентных клеток и угнетение функции Т-супрессоров;
• активация процесса захвата антигена и его переработки макрофагами.
Адъюванты повышают иммуногенность вакцин в десятки и более раз, особенно молекулярных белковых антигенов (анатоксинов), которые без адъювантов быстро расщепляются ферментами организма. Примеры: АД, АДС, АС-анатоксины, стафилококковый анатоксин.
Ассоциированные вакцины и поливакцины. Препараты, которые содержат комплекс различных антигенов и применяются для одновременной иммунизации против нескольких инфекций. Примеры: АКДС, сек-стаанатоксин (сорбированные на гидроокиси алюминия столбнячный, бо-тулинический А, В, Е и гангренозные перфрингенс и нови-анатоксины);
полиомиелитная-живая пероральная вакцина из 3-х аттенуированных штаммов вирусов I, II, III типов; живая вакцина против кори, краснухи, паротита.
Различают первичную иммунизацию (вакцинацию) и повторную иммунизацию (ревакцинацию). При первичной иммунизации создается первичный активный искусственный иммунитет и повышенная способность реагировать на антиген (иммунологическая память), в результате чего при ревакцинации организм более активно и быстро отвечает на антиген. Вакцины, анатоксины обеспечивают выработку специфического активного искусственного иммунитета спустя 2-3 недели после первичной иммунизации и через 2-7 после ревакцинации (повторной иммунизации).
В нашей стране, в соответствии с принятым федеральным законом №157, ФЗ "Об иммунопрофилактике инфекционных заболеваний", проводится обязательная вакцинация против туберкулеза, гепатита В, полиомиелита, коклюша, дифтерии, столбняка, кори, коревой краснухи, паротита. В "календаре" (с 2002г.) указаны схемы и сроки прививок с момента рождения и в определенные периоды жизни каждого человека.
| Возраст | Вакцинация |
| Новорожденные (до12 часов жизни) | Первая вакцинация против вирусного гепатита В |
| Новорожденные (3-7 дней) | Вакцинация против туберкулеза |
| 1 месяц | Вторая вакцинация против вирусного гепатита В |
| 3 месяца | Первая вакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита |
| 4,5 месяца | Вторая вакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита |
| 6 месяцев | Третья вакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка. Третья вакцинация против гепатита В. |
| 12 месяцев | Вакцинация против кори, краснухи, эпидемического паротита |
| 18 месяцев | Первая ревакцинация (повторная вакцинация) против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита |
| 20 месяцев | Вторая ревакцинация против полиомиелита |
| 6 лет | Ревакцинация против кори, краснухи, эпидемического паротита |
| 7 лет | Ревакцинация против туберкулеза, Вторая ревакцинация против дифтерии и столбняка |
| 13 лет | Вакцинация против краснухи (девочки), вакцинация против гепатита В (ранее не привитым) |
| 14 лет | Третья ревакцинация против дифтерии, столбняка, туберкулеза, полиомиелита |
| Взрослые | Ревакцинация против дифтерии и столбняка каждые 10 лет после последней ревакцинации |
Вакцины лечебные назначают при затяжных формах инфекций (дизентерия, бруцеллез, орнитоз, сап, брюшной тиф), для активации иммунитета и десенсибилизации организма. Лучший лечебный эффект имеют ауто-вакцины, т.е. вакцины, приготовленные из собственных микроорганизмов, вызвавших заболевание (фурункулез).
Иммунные сыворотки и гамма - глобулины. Применяются для экстренной защиты (пассивная иммунизация) организма от заболевания (лиц, пребывающих в инкубационном периоде или уже заболевших). По механизму действия сыворотки бывают антитоксические (противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулиническая) и антимикробные (противоменингококковая).
Из сывороток получают концентрированный препарат - гамма-глобулин. Гетерологичный гамма-глобулин получают из сыворотки гипериммунизированных животных (против бешенства, сибирской язвы). Гомоло- г ичный гамма-глобулин получают из плацентарной и донорской крови 1юдей, имеющих высокие титры антител против определенных антигенов противогриппозный, противокорввый, противостолбнячный гамма глобулин). Гомологичные гаммаглобулины (и антисыворотки), в отличие от гетерологичных, при введении почти не вызывают аллергических осложнений).
К иммунобиологическим препаратам также относятся бактериофаги и эубиотики.
Бактериофаги - препараты, в которых содержатся вирусы бактерий, способные поражать бактерии. Применяют для профилактики и лечения эяда бактериальных инфекций (брюшной тиф, дизентерия, холера, гноите инфекции). Эти препараты также назначаются с профилактической целью контактным в очагах.
Лечебный и профилактический эффект фагов умеренный, поэтому их применяют в комплексе с другими лечебными и профилактическими препаратами.
Диагностические бактериофаги используются для фагодиагностики и фаготипирования бактерий, что имеет эпидемиологическое значение.
Эубиотики-препараты, приготовленные из живых, выращенных на питательных средах непатогенных бактерий, относящихся к облигатным представителям нормальной микрофлоры человека (бифидумбактерии, лактобактерии, кишечная палочка, энтерококки). Соответственно препараты эубиотиков называют: "Бифидумбактерин", "Лактобактерин" "Колибактерин", 1 доза эубиотиков составляет 107 -108 микробных клеток. Их применяют через рот, два-три раза в день, длительными курсами (1-6 месяцев). В аптечную сеть для реализации поступают в основном сухие лиофилизированные препараты. Но более эффективными являются жидкие свежеприготовленные эубиотики, поскольку, кроме бактерий, в жидкости уже содержатся в большом количестве биологически активные вещества. Часто их называют «заквасками», потому что с их помощью можно заквашивать молоко, используя в качестве лечебно-профилактического продукта. Эубиотики восстанавливают видовой и количественный состав бактерий, нарушенный в результате дисбактериоза, повышают устойчивость организма к инфекциям.
Пробиотики кроме живых микроорганизмов, входящих в состав нормальной микрофлоры человека или выделенных из внешней среды, могут содержать ферменты, биологическиактивные вещества и другие компоненты, способствующие формированию нормального микробиоценоза. Например: "Бактисубтил", "Линекс".
Для иммунокоррекции применяются также и многие другие неспецифические иммуностимулирующие препараты различного происхождения.
Тималин. Представляет собой комплекс полипептидных фракций, выделенных из вилочковой железы крупного рогатого скота. Регулирует количество Т- и В- лимфоцитов, стимулирует реакцию клеточного иммунитета, усиливает фагоцитоз.
Тактивин. Препарат полипептидной природы, получен из тимусов крупного рогатого скота. Нормализует качественные и количественные показатели Т системы иммунитета, стимулирует продукцию лимфокинов, в том числе интерферонов.
Левомизол. Тетрагидро-6-фенилимидазо-тиазоло гидрохлорид. Стимулирует регуляторную функцию Т-лимфоцитов, нормализует клеточный иммунитет.
Натрия нуклеинат. Натриевая соль нуклеиновой кислоты, получаемой гидролизом дрожжей и дальнейшей очисткой. Стимулирует деятельность костного мозга, вызывает лейкоцитарную реакцию, стимулирует лейкопоэз.
Продигиозан. Высокополимерный липополисахаридный комплекс, выделенный из микроорганизмов Serratia marcescens. Стимулирует факторы неспецифической и специфической резистентности организма. Активирует Т- систему и функцию коры надпочечников.
Пирогенал. Липополисахарид, микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi. При введении в организм вызывает повышение температуры и сдвиги в функциях организма: лейкопения, сменяющаяся лейкоцитозом, увеличение проницаемости тканей, улучшение восстановительных процессов.
Полиоксидоний. Синтетический полимер. Стимулирует активность макрофагов, а также Т- и В-лимфоцитов.
Миелопид. Комплекс пептидов из костного мозга. Оказывает влияние на все компоненты иммунной системы.
Ликопид. Производное мурамилпептидов клеточной стенки бактерий L. bulgaricus, стимулирует функцию макрофагов.
Цели занятия:
1. Ознакомить студентов с критериями необходимости изучения иммунного статуса у определенной категории больных, с принципами и методами проведения этих исследований.
2. Познакомить студентов с иммунобиологическими препаратами, применяемыми для иммунопрофилактики, иммунотерапии (иммунокоррекции) инфекционных заболеваний у человека.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Иммунодефицитные состояния: классификация, причины и механизм их возникновения, принципы и методы диагностики.
2. Принципы и методы повышения специфической и неспецифической резистентности к инфекционным заболеваниям человека.
3. Препараты, применяемые для создания активного и пассивного иммунитета и повышения эффективности неспецифической защиты от инфекций. Их классификацию и принципы получения.
4. Календарь прививок.
Уметь:
1. Обосновать необходимость проведения обследования иммунного статуса пациента, дать объективную оценку по результатам иммунограммы.
2. Обосновать необходимость применения вакцин, сывороточных и иммуностимулирующих (неспецифических) препаратов.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Для оценки функционального состояния иммунной системы и диагностики патологических изменений её активности разработаны специальные клинические и лабораторные методы, которые предполагают дифференцированную характеристику функциональной активности Т- и В-систем иммунитета. Количественная оценка Т-лимфоцитов:
1. Реакция спонтанного розеткообразования с отмытыми эритроцитами барана (Е-розетки).
2. Идентификация с помощью СD-маркёров.
Количественная оценка В-лимфоцитов:
1. Реакция розеткообразования с эритроцитами, сенсибилизированными 1д и комплементом (ЕАС-розетка).
2. Идентификация с помощью СD-маркёров.
Функциональная оценка Т-звена иммунитета:
1. Реакция бласттрансформации Т-лимфоцитов в результате неспецифической стимуляции Т-митогенами: фитогемагтлютинин (ФГА), конканавалин А (Кон).
2. Реакция лимфоцитотоксичности в смешанной культуре лимфоцитов (М1-С).
3. Продукция Т-лимфоцитами лимфокинов.
Функциональная оценка В-звена иммунитета:
1. Определение уровня основных классов иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии (реакция Манчини).
2. Неспецифическая стимуляция лимфоцитов В-митогенами (LPS PWM).
В основе определения принадлежности лимфоцитов к той или иной субпопуляции лежат следующие характеристики:
1. Наличие на поверхности лимфоцитов антигенных маркеров (СD-антигены: сеll differentiation antigens или cluster definition- антигены кластеров дифференцировки клеток), которые представляют собой гликопротеины (gp), специфичные для определенной стадии дифференцировки (СD-"кластер" дифференцировки. Такие антигены выявляются с помощью люминесцирующих моноклональных антител.
2. Наличие на поверхности лимфоцитов рецепторов, с помощью которых лимфоциты распознают антигены и некоторые другие химические структуры:
а) рецептор для эритроцитов барана - специфический маркер для Т-лимфоцитов человека (В-лимфоциты его не имеют) выявляется с помощью розеткообразования с эритроцитами барана (Е-розетки).
б) Fс-рецептор для Fс фрагмента иммуноглобулинов. Он присутствует у В-лимфоцитов. Если эритроциты барана обработать иммуноглобулинами, то В-лимфоциты способны образовывать розетки с такими эритроцитами (антительные Е-розетки).
в) С-рецептор для комплемента. Присутствует у В-лимфоцитов. Поскольку комплекс антиген-антитело способен присоединять комплемент, этот принцип используется для постановки ЕАС - розеток в целях выявления В-лимфоцитов (эритроциты барана сенсибилизируются антителами и комплементом).
Функциональные различия Т- и В-лимфоцитов можно выявить in vitro. Для этой цели чаще всего применяют реакцию бласттрансформации. Она основана на способности малых лимфоцитов при культивировании их in vitro превращаться под влиянием митогенного стимула в бластные формы, проявляющие при этом большую митогенную активность. В качестве митогенного стимула могут быть использованы аллогенные антигены гистосовместимости (микст-культура лимфоцитов - МLC) или некоторые субстанции растительной или бактериальной природы- Среди митогенов выделяют митогены для Т-лимфоцитов (ФГА и Кон А), и митогены для В-: лимфоцитов (ЛПС клеточной стенки бактерий и Р\Л/М - из растения фитолаки).
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Микропрепараты Е-РОК, ЕАС-РОК.
2. Микропрепараты реакции бласттрансформации лимфоцитов.
3. Реакция Манчини на стеклах с агарозным гелем для определения разных классов иммуноглобулинов.
4. Наборы вакцинных препаратов; наборы иммунных сывороток, гаммаглобулинов (лечебных и диагностических). Набор аллергенов.
5. Наборы эубиотиков, бактериофагов, цитокинов.
6. Таблицы, схемы, рисунки.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Микроскопия препаратов Е-РОК для подсчета Т-клеток.
2. Микроскопия препаратов ЕАС-РОК для подсчета В-клеток.
3. Микроскопия препаратов с реакцией бласттрансформации.
4. Учет реакции радиальной иммунодиффузии (реакцмя Манчини) для определения уровня различных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови.
5. Оценка иммунного статуса по готовым бланкам иммунограммы больных.
6. Знакомство с наборами вакцинных препаратов, иммунных сывороток, иммуноглобулинов, аллергенов, неспецифических иммуномодуляторов.
7. Знакомство с препаратами эубиотиков, бактериофагов, цитокинов.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Что такое иммунный статус человека, какие показатели его характеризуют?
2. В каких случаях изучают иммунный статус?
3. Иммунодефицитные заболевания: принципы классификации, этиология и патогенез их развития.
4. Аутоиммунные заболевания: причины возникновения, применение иммунологических методов для их диагностики
5. По каким маркерам можно отличить Т- и В-лимфоциты?
6. Что такое антигены дифференцировки (СD-антигены), каково их практическое значение в клинической иммунологии, как их определить?
7. Что такое мембранные иммуноглобулины, для каких клеток они характерны и как их определить?
8. Что такое прямые (Е-РОК) и непрямые (ЕА-РОК, ЕАС-РОК) розетки, в каких случаях их определяют?
9. Как определить функциональную активность Т- и В-лимфоцитов in vitro и in vivo?
10. Что такое реакция бласттрансформации?
11. Какие митогены применяются в клинической иммунологии и с какой целью? (Классификация и примеры).
12. Как оценивается функциональная активность В-звена иммунной системы?
13. В чем суть реакции радиальной иммунодиффузии (р. Манчини) и с какой целью она ставится?
14. Каковы принципы иммунокоррекции первичных и вторичных имму-нодефицитов?
15. Что такое вакцины (классификация) и каковы принципы их получения?
16. В каких случаях применяются лечебные вакцины?
17. Что такое химическая вакцина?
18. Каковы принципы получения генно-инженерных вакцин?
19. В каких случаях используется такой метод их получения?
20. Что такое анатоксин, как он получается и для чего применяется?
21. Что такое адъюванты, для чего они применяются, каков механизм их действия?
22. Что такое «адъювантная» болезнь, в каких случаях она может возникать?
23. Что такое «календарь прививок», какие вакцины при этом применяются?
24. Что такое «коллективный» иммунитет, как он создается и какое это имеет значение для предупреждения инфекционных заболеваний?
25. Какими недостатками обладают современные вакцины и каковы пути их устранения?
26. Как получить иммунные сыворотки и для чего они применяются?
27. Что такое гомологичные и гетерологичные гаммаглобулины, как они получаются, для чего используются?
28. Какие осложнения могут возникать у пациента после введения гете-рологичных сывороточных препаратов и как их избежать?
29. Какие препараты применяются для неспецифической иммунокоррекции и каков механизм их действия?
|
|
|
