ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПУНКТАТА КОСТНОГО МОЗГА
Настоящая стандартизованная технология устанавливает единые требования при выполнении Цитологического исследования пунктата костного мозга в гематологических и клинико-диагностических лабораториях медицинских организаций
1. Цель исследования
Исследование клеточных элементов в мазке пунктата костного мозга (миелограмма), является одним из основных методов, который позволяет оценить процессы пролиферации и дифференцировки отдельных ростков кроветворения, его клеточный состав и функциональное состояние. Исследование пунктата костного мозга необходимо при диагностике различных гемобластозов, анемий, лизосомных болезней накопления, метастазов рака и других заболеваний [1].
Цель внедрения технологии «Цитологическое исследование пунктата костного мозга» определяется необходимостью установления единых правил: доставки материала в гематологическую лабораторию, требований к качеству мазка, его фиксации, окраски, микроскопического изучения; описания и оценки результатов исследования.
Согласно ГОСТ Р ИСО15189 [2], стандартизация и соблюдение указанных правил позволит получить правильную информацию о результатах исследования пунктата костного мозга для ранней диагностики заболеваний, оценки эффективности проводимого лечения.
2. Требования к обеспечению выполнения технологии
Требования к специалистам и вспомогательному персоналу
Перечень специалистов с высшим и средним образованием, участвующих в выполнении технологии:
- врач клинической лабораторной диагностики;
- специалист со средним медицинским образованием.
Требования к образованию специалистов
Цитологическое исследование мазка пунктата костного мозга имеют право проводить врачи клинической лабораторной диагностики, прошедшие специализацию и повышение квалификации в установленном порядке и имеющие сертификат специалиста. Подготовительную работу выполняет специалист со средним медицинским образованием, имеющий соответствующий сертификат (медицинского технолога, медицинского лабораторного техника (фельдшера - лаборанта) или лаборанта.
Работа по выполнению указанной методики в лаборатории распределяется следующим образом:
персонал со средним медицинским образованием проводит: прием, регистрацию полученного биологического материала и мазков костного мозга; фиксацию и окрашивание мазков пунктата костного мозга, подсчет количества клеток в камерах, регистрацию заключения, архивирование препаратов;
врачи клинической лабораторной диагностики проводят исследование мазков костномозгового пунктата, описывают и оценивают миелограмму, делают заключение о характере патологического процесса.
Требования к знаниям и умениям специалистов должны соответствовать образовательным стандартам.
Требования к обеспечению безопасности труда медицинского персонала
Требования по безопасности труда при выполнении технологии соответствуют общим правилам безопасности при работе в клинико-диагностической лаборатории согласно ГОСТ Р ИСО 15190 [3]. Должны соблюдаться правила биологической безопасности, правила сбора и удаления отходов [4, 5], правила работы с электроприборами и реактивами, пожарной безопасности.
Материальные ресурсы, необходимые для выполнения технологии
Материальные ресурсы даны в расчете для проведения исследования препаратов костного мозга от одного больного (обследуемого), таблица 1.
Т а б л и ц а 1 - Материальные ресурсы для выполнения цитологического
исследования пунктата костного мозга
№
Наименование
Количество
Не менее
Приборы, изделия медицинской техники, оборудование:
1.
Микроскоп бинокулярный с иммерсионной системой и встроенным осветителем
1
2.
Камеры Горяева и Фукса-Розенталя
2
3.
Аппарат для получения дистиллированной воды
1
4
Весы аналитические с разновесом или электронные
1
5.
Таймер лабораторный
1
6.
Счетчик для подсчета лейкоцитарной формулы
1
7.
Кюветы для фиксации и окраски мазков[1]
2
8.
Штатив–контейнер для предметных стекол *
2
9.
Штатив для пробирок
1
10.
Контейнер переносной для транспортировки биологического материала
1
11.
Штатив для пипеток
1
12.
Устройство для фиксации и окрашивания мазков крови на предметном стекле (автоматическое) *
1
14.
Рельсы для окрашивания мазков *
2
15.
Лотки *
2
Стеклянные изделия:
16.
Стекло предметное (с матовым полем для маркировки), размер 23 х 76 х 1,1 мм или
23 х 76 х 1,8 мм
10
10
17.
Стекло предметное, шлифованный край, размер 21 х 76 х 1,1 мм
2
18.
Стаканы химические 40 мл, 400 мл
4
19.
Стаканы без метки 200 мл
4
20.
Цилиндры мерные 100 мл, 500 мл
2
21.
Пипетки объемом: 0,02мл, 0,4мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл или автоматические дозаторы с изменяющимся объемом
4
22.
Пробирки химические с герметично закрывающимися пробками (10 мл)
5
23
Пробирки пластиковые одноразовые с крышками на 0.5-1.0 мл,
содержащие 1,6 мг ЭДТА-К2 или с напылением ЭДТА-К2
Реактивы:
23.
Панхромные растворы:
· фиксаторы-красители эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду или Лейшману;
· краситель азур–эозин по Романовскому.
50 мл
45 мл
24.
Азур ІІ
1,0 г
25.
Эозин калия
1,0 г
26.
Эфир диэтиловый во флаконах
100 мл
27.
Дигидрофосфат калия
0,5 г
28.
Гидрофосфат натрия
1,0 г
29.
Этанол 95о [2]*
80 мл
30.
Уксусная кислота 3,5%
4 мл
31.
Иммерсионное масло
1 мл
32.
Хлорамин или другое дезинфицирующее средство
30 г
Расходуемый материал:
33.
Перчатки хирургические, резиновые
2
34.
Вода дистиллированная
по потребности
35.
Шпатели
2
3. Характеристика выполнения цитологического исследования пунктата костного мозга
Технология исследования пунктата костного мозга включает следующие последовательные этапы:
- доставка, прием и регистрация биологического материала;
- фиксация и окрашивание мазков пунктата костного мозга;
- микроскопия: подсчет и исследование морфологии клеток костного мозга;
- оценка результатов подсчета и исследования морфологии клеток костного мозга;
- оценка правильности заключения (контроль качества цитологического исследования пунктата костного мозга);
- регистрация заключений и архивирование препаратов.
3.1. Доставка, прием и регистрация биологического материала
Во время транспортировки не допускается контакт предметного стекла (с нативным материалом) и бланка – направления, в соответствии с правилами биологической безопасности. Пробирки с пунктатом костного мозга и высушенные мазки доставляют в лабораторию в день взятия в специальных контейнерах.
П р и м е ч а н и е ¾ Если в лабораторию поступает пунктат с антикоагулянтом, материал немедленно регистрируют и передают лаборанту для приготовления мазков.
Сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить:
- правильность оформления направления: в бланке – направлении указываются данные обследуемого (ФИО, возраст, № истории болезни или амбулаторной карты, отделение, диагноз, проведенная терапия);
- маркировку мазков и пробирок с пунктатом костного мозга (на них должны быть нанесены код или фамилия больного, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для исследования).
Лаборант должен отметить количество мазков и пробирок в бланке - направлении и зарегистрировать получение материала в лабораторном журнале.
П р и м е ч а н и е ¾ Присланные для исследования препараты костного мозга: пунктат с гемолизирующим раствором и мазки - готовы к исследованию.
Фиксация и окрашивание мазков пунктата костного мозга
3.2.1 Общие правила фиксации и окрашивания мазков пунктата костного мозга:
- из доставленного в лабораторию пунктата с антикоагулянтом немедленно готовят 10-12 мазков; 20 мкл пунктата смешивают с 0,4 мл 3,5% раствора уксусной кислоты;
- из полученных или приготовленных непосредственно в лаборатории 10-12 мазков для цитологического исследования отбирают 3, их фиксируют, окрашивают и исследуют.
П р и м е ч а н и е ¾ Оставшиеся препараты предназначены для консультации у профильного специалиста в случае диагностических затруднений или, при наличии более 10% бластов, - для проведения цитохимических исследований в гематологической лаборатории. Эти препараты, нефиксированные и некрашеные, хранят при комнатной температуре не более 1.5 мес. При отсутствии необходимости в консультации или в цитохимическом исследовании, а особенно у первичных пациентов или при низкой клеточности пунктата, дополнительно обрабатывают и изучают все оставшиеся мазки.
- фиксация и окрашивание мазков пунктата костного мозга может выполняться вручную или автоматически с помощью специальных устройств, в которые загружаются нефиксированные мазки. Последующее автоматическое дозирование фиксатора-красителя и буферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску;
- вручную фиксация и окрашивание мазков пунктата костного мозга проводится аналогично фиксации и окрашиванию препаратов периферической крови.
- применение любой методики фиксации и окрашивания мазков требует точного соблюдения последовательности процедур при приготовлении растворов и временных промежутков в течение процесса фиксации и окрашивания.
Фиксация мазков выполняется либо как предварительный этап перед окрашиванием, либо одновременно с окрашиванием, если по технологии используются растворы готовых панхромных красителей.
Подготовительная работа для выполнения фиксации и окрашивания мазков состоит: в приготовлении буферного раствора, основных и рабочих растворов красителей, подготовке оборудования.
3.2.2 Методика фиксации и окрашивания мазков пунктата костного мозга по Нохту[3]
Для фиксации и окрашивания мазков необходимо приготовить следующие реактивы:
а) приготовление фосфатного буфера (рН 7,0). Для приготовления основного раствора фосфатного буфера необходимо приготовить навески следующих солей:
КН2РО4 (однозамещенного, безводного) - 0,49 г;
Nа2 НРО4 (двузамещенного, безводного) - 0,909 г;
Навески солей растворяют в дистиллированной воде, в объеме до 1000 мл.
П р и м е ч а н и е ¾ Для приготовления буферного раствора (рН 7,0) допустимо использование готовых форм (смеси фосфатных солей в виде таблеток, навесок).
б) приготовление основных и рабочего растворов красителей:
1) основной раствор азура ІІ: 1г краски растворяют в 1л дистиллированной воды. Оставляют в посуде из темного стекла на 12 -14 дней при комнатной температуре или в термостате при 37о С на 6-8 дней;
2) основной раствор эозина калия: 1г краски растворяют в 1л дистиллированной воды. Оставляют в посуде из темного стекла на 12 -14 дней при комнатной температуре или в термостате при 37о С на 6-8 дней;
3) рабочий раствор азур-эозина: перед окрашиванием мазков смешивают с 25 мл основного раствора азура ІІ, 20 мл основного раствора эозина калия и 55 мл буферного раствора. Пропорции красителей могут варьировать, их устанавливают опытным путем при приготовлении свежих основных растворов.
в) приготовление смеси Никифорова:
- смесь Никифорова готовится из этилового спирта (40 мл) и диэтилового эфира (40 мл) в пропорции 1:1. Смесь используется: для хранения чистых предметных стекол.
Фиксация мазков [4]
Реактив (краситель-фиксатор): раствор эозин-метиленового синего по Май-Грюнвальду или по Лейшману.
Оборудование: кювета для фиксации и окраски мазков со штативом-контейнером (или широкогорлая посуда с притертой пробкой).
Последовательность процедур:
- мазки помещают в штатив-контейнер и опускают его в кювету с фиксатором на 5мин.;
- вынимают контейнер из фиксирующего раствора.
Окрашивание мазков.
Оборудование:
- кювета для окраски мазков со штативом-контейнером (или лотки со специальными «рельсами» для окраски мазков);
- химические стаканы низкие (для разведения красителей).
Реактивы:
- рабочий раствор азур–эозина;
Последовательность процедур:
- контейнер с фиксированными мазками переносят в кювету с рабочим раствором красителя (или фиксированные мазки располагают горизонтально на специальные рельсы и наливают по 3-4 мл красителя на каждый из препаратов), на 20 - 45 минут [5];
- смывают краску водопроводной водой;
- окрашенные и промытые мазки высушивают на воздухе в течение 15 –20 минут.
4.2.3 Методика окрашивания мазков пунктата костного мозга по Паппенгейму[6] [6].
Реактивы:
- раствор фиксатора-красителя по Май–Грюнвальду;
-раствор азур-эозина по Нохту или готовый краситель Романовского–Гимзы, разведенный фосфатным буфером в 10 - 20 раз;
Последовательность процедур:
- сухие нефиксированные мазки аккуратно помещают в штатив-контейнер для окраски мазков или располагают горизонтально на специальные рельсы;
- штатив-контейнер опускают в кювету с раствором фиксатора-красителя на 3 - 5 минут, или наливают по 3 - 4 мл фиксатора-красителя на каждый из препаратов, находящихся на рельсах;
- контейнер с мазками ополаскивают в кювете с дистиллированной водой в течение 1 минуты или на мазок, не сливая фиксатор-краситель, добавляют дистиллированную воду на 1 мин;
- помещают контейнер с мазками в кювету с рабочим раствором азур-эозиновой краски по Нохту (или по Романовскому-Гимзе) на 8 -10 минут или наливают краситель на мазки, находящиеся на рельсах;
