 |
Микроскопия: подсчет и исследование морфологии клеток костного мозга.
|
|
|
|
3.3.1 Подсчет миелокариоцитов в счетной камере и окрашенных мазках костного мозга
Оборудование: бинокулярный микроскоп, счетная камера Горяева.
В счетной камере Горяева подсчет миелокариоцитов проводится в 5 или 100 больших квадратах. В настоящем стандарте приведены 2 способа подсчета.
3.3.1.1 Последовательность процедур (1 способ):
- доставленную в лабораторию взвесь пунктата костного мозга в растворе 3,5 % уксусной кислоты (разведение в 20 раз) тщательно перемешивают;
- заполняют взвесью камеру Горяева, подсчет клеток проводят через 1 - 2 минуты;
- миелокариоциты считают в 5 больших квадратах (аналогично подсчету числа эритроцитов).
Количество миелокариоцитов рассчитывают по формуле:
n x 20x 250 х 106
X =-------------------- = n x109, где
5
Х – количество миелокариоцитов в 1 литре; n - количество миелокариоцитов в 5 больших квадратах; 20 – разведение костного мозга; 250 – коэффициент пересчета на 1 мкл (объем одного большого квадрата 1/250), 106 - коэффициент пересчета на 1 литр.
При высокой клеточности (более 50 клеток в большом квадрате камеры), пунктат костного мозга перед подсчетом следует дополнительно развести в 5 или 10 раз 3,5 % раствором уксусной кислоты. Общее разведение - соответственно в 100 или 200 раз учитывается при расчете количества миелокариоцитов.
3.3.1.2 Последовательность процедур (2 способ).
Если клеточность пунктата низкая (в большом квадрате камеры обнаруживают менее 5 клеток), клетки необходимо считать в 100 больших квадратах (аналогично подсчету лейкоцитов). Количество миелокариоцитов рассчитывают по формуле:
n x 20x 250 х 106
X =-------------------- = n x 50 х 106, где
|
|
|
100
n – количество миелокариоцитов в 100 больших квадратах.
Нормальные величины: количество миелокарицитов колеблется в широких пределах: 41, 6 x109 – 195, 0 x109 в 1 л; до 250, 0 x109 в 1 л [7,8].
3.3.1.3 Подсчет миелокариоцитов в окрашенных мазках костного мозга.
Ориентировочная оценка клеточности костного мозга проводится при микроскопическом изучении окрашенных мазков. Для этого просматривают весь препарат на малом увеличении (10÷40) х 10 и выбирают участок мазка для подсчета, который должен быть тонким (все клетки располагаются в один слой) и, в то же время клеточным – содержать преимущественно костномозговые элементы. Далее изучают препарат под иммерсией при увеличении 100 х 10.
Количество миелокариоцитов считается нормальным, если при просмотре препарата иммерсионным объективом в каждом поле зрения встречается 15 - 25 миелокариоцитов. При количестве миелокариоцитов менее 15 в поле зрения, костный мозг оценивается как гипоклеточный, более 25 - как гиперклеточный.
3.3.2 Подсчет мегакариоцитов во взвеси костного мозга и окрашенных мазках
Подсчет мегакариоцитов во взвеси костного мозга выполняется в камерах Горяева и Фукса-Розенталя:
- мегакариоциты подсчитывают в той же счетной камере Горяева, где проводился подсчет миелокариоцитов (используется взвесь костного мозга в разведении 1:20). Подсчет гигантских клеток проводится по всей сетке камеры Горяева. Количество мегакариоцитов рассчитывают по формуле:
X = n x 20 х 106, где
Х – количество мегакариоцитов в 1 л; n – количество мегакариоцитов во всей камере; 20 – разведение костного мозга.
- для подсчета мегакариоцитов в счетной камере Фукса-Розенталя
используется взвесь костного мозга в разведении 1:20. Подсчет мегакариоцитов проводится по всей сетке камеры Фукса-Розенталя. Количество клеток рассчитывают по формуле:
|
|
|
n x 20
X =---------- х 106, где
3,2
Х – количество мегакариоцитов в 1 л; n – количество мегакариоцитов по всей камере; 20 – разведение костного мозга; 3,2 мкл – объем камеры Фукса-Розенталя.
Нормальные величины: количество мегакариоцитов составляет 50,0 х 106 –150,0 х 106 в 1 л.*
Подсчет мегакариоцитов в окрашенных мазках костного мозга проводится под малым увеличением (10х10, 20х10). Препарат просматривается в области щеточки, где преимущественно концентрируются мегакариоциты.
Количество в препарате более 2-3 мегакариоцитов считается нормальным.
3.3.3 Морфологическое исследование и подсчет форменных элементов костного мозга (миелограммы)
В настоящем стандарте приведена методика М.И. Аринкина [9] для морфологического исследования костного мозга и подсчета его форменных элементов (миелограммы). Миелограмма – процентное соотношение всех кроветворных клеток костного мозга (миелокариоцитов). После дифференцированного подсчета оцениваются морфологические особенности клеток, кинетика созревания и составляется заключение по миелограмме в целом, при обязательном сопоставлении с показателями гемограммы.
Реактивы:
- иммерсионное масло;
- диэтиловый эфир.
Оборудование:
- микроскоп;
- счетчик для подсчета миелограммы (лейкоцитарной формулы).
Последовательность процедур:
- предварительное изучение окрашенных препаратов костного мозга проводится под малым увеличением (40 х 10);
П р и м е ч а н и е ¾ Исследование мазка под малым увеличением позволяет выбрать участки препарата для подсчета миелограммы (миелокариоциты и эритроциты лежат в один слой, отдельно друг от друга). Выявляются: клеточность костного мозга; наличие и число мегакариоцитов; состав (характер) костномозгового пунктата; крупные клеточные элементы или скопления клеток (клетки Гоше, клетки Ниммана-Пика, метастазы рака в костный мозг и др.).
- после предварительного изучения мазка, на препарат наносится капля иммерсионного масла, в которую погружают иммерсионный объектив, и проводится подсчет клеток под увеличением (90-100)х10. Подсчитывают все, встречающиеся в поле зрения миелокариоциты, не менее 500 клеток в разных участках 3 или более препаратов, регистрируя их число с помощью счетчика;
|
|
|
- вычисляется процентное соотношение каждого вида клеток.
Дополнительную информацию для оценки костномозгового кроветворения получают при расчете следующих индексов: лейкоэритробластическое соотношение (Л/Э), индекс созревания нейтрофилов (ИСН), индекс созревания эритрокариоцитов (ИСЭ), парциальная эритронормобластограмма, способы, вычисления которых приведены в приложении А.
4. Оценка результатов подсчета и исследования морфологии клеток костного мозга, индексов костномозгового кроветворения.
Результатом цитологического исследования пунктата костного мозга является характеристика костномозгового кроветворения, которая включает в себя:
- оценку подсчета клеточности костного мозга; процентного состава миелокариоцитов; индексов миелограммы;
- описание миелограммы и морфологических особенностей гемопоэза.
Полученные результаты подсчета количества миелокариоцитов, мегакариоцитов, миелограммы и индексов мозгового кроветворения сравниваются с референтными значениями состава клеток пунктата костного мозга, полученными при обследовании здоровых взрослых пациентов и детей (таблица 2). Результаты даны в принятых статистических критериях: средней арифметической результатов, полученных в группе обследуемых лиц (
) и среднеквадратическом отклонении (Ѕ), которое характеризует разброс результатов от среднего арифметического значения.
Т а б л и ц а 2 - Референтные пределы значений показателей пунктата
костного мозга
| Показатель, единицы | У взрослых [7]
( ) ± 1,5 Ѕ
| У новорож-
ден н ых**
() ± 1, 0 Ѕ
| Возраст 3 года**
()± 1, 0 Ѕ
| Возраст 5-6 лет***
()± 1, 0 Ѕ
|
| Количество миелокариоцитов х 10 9 /л | 41,6 - 195,0 | 146,5 -222,5 | 170,8 - 296,8 | 100,4-300,0 |
| Количество мегакариоцитов х 10 6 /л | 50,0 – 150,0 | 51,8-108,2 | 53,8 - 113.8 | 52,8 -157,2 |
| Бласты Миелобласты (%) | 0,1 – 1,1 0,2 - 1,7 | 0,7 – 2,1 0,8 -1,8 | 1,3 -2,7 0,8-3,3 | 0 -1,2 1,5 – 3,6 |
| Нейтрофильные промиелоциты(%) | 1,0 – 4,1 | 4,2 – 6,2 | 2,8 – 5,8 | 1,2 -3,8 |
| Нейтрофильные миелоциты(%) | 7,0 – 12,2 | 8,1 – 12,3 | 8,5 – 11,9 | 4,2 – 8,7 |
| Нейтрофильные метамиелоциты(%) | 8,0 -15,0 | 6,8 - 8,8 | 7,1 - 9,0 | 6,5 – 10,3 |
| Палочкоядерные нейтрофилы(%) | 12,8 – 23,7 | 20,0 - 25,2 | 14,0 - 25,4 | 13,2 – 24,0 |
| Сегментоядерные нейтрофилы(%) | 13,1 – 24,1 | 18,0 - 23,6 | 13,3 - 22,5 | 8,3 -13,9 |
| Все нейтрофильные элементы(%) | 52,7 – 68,9 | 43,0 -54,7 | ||
| Эозинофилы всех генераций(%) | 0,5 – 5,8 | 2,7 – 5,3 | 2,8 - 6,8 | 2,4 – 7,4 |
| Базофилы(%) | 0 – 0,5 | 0 – 0,3 | 0 – 0,1 | 0,2 – 0,8 |
| Лимфоциты(%) | 4,3 -13,7 | 2,0 – 3,8 | 6,7 – 14,6 | 18,7 – 29,5 |
| Моноциты(%) | 0,7 – 3,1 | 0 - 0,1 | 0 - 0,2 | 1,8 – 5,5 |
| Плазматические клетки(%) | 0,1 -1,8 | 0,1 - 0,1 | 0 - 0,3 | 0 - 0,5 |
| Эритробласты(%) | 0,2 – 1,1 | 1,0 – 1,8 | 0,8 – 2,0 | 0,3 – 1,0 |
| Пронормобласты | 0,1 -1,2 | |||
| Нормобласты: базофильные(%), | 1,4 -4,6 | 2,5 – 5,1 | 1,4 -3,4 | 1,2 – 2,4 |
| ---«---полихроматофильные(%), | 8,9 -16,9 | 6,9 - 10,6 | 7,5 – 11,2 | 7,8 -16,0 |
| ---«--- оксифильные(%) | 0,8 -5,6 | 5,9 -10,0 | 5,5 -7,3 | 0,1 -1,9 |
| Все эритрокариоциты(%) | 14,5 – 26,5 | 11,3 -19,4 | ||
| Ретикулярные клетки | 0,1 – 1,6 | 0,6 – 1,9 | 0,1 – 1,4 | 0,2 – 1,2 |
| Лейкоэритробластическое отношение | 2,1 - 4,5 | 3,0 – 4,4 | 3,2 – 5,0 | |
| Индекс созревания эритрокариоцитов | 0,8 - 0,9 | |||
| Индекс созревания нейтрофилов | 0,5 - 0,9 |
|
|
|
П р и м е ч а н и е ¾ В настоящее время ретикулярные клетки не учитываются при подсчете миелограммы
4.1. Описание миелограммы
В описании миелограммы отмечают наличие качественных и количественных особенностей отдельных ростков кроветворения, морфологические признаки патологически измененных клеток (размер, форма клеток и ядер, соотношение ядра и цитоплазмы, характер хроматина, наличие нуклеол, цвет и зернистость цитоплазмы и т. п.). Описание миелограммы проводят по определенной схеме, последовательность и термины приведены в таблице 3.
Т а б л и ц а 3 - Примерная схема описания миелограммы
| Параметр (показатель) | Описание |
| Клеточность пунктата | - нормальное содержание клеток - сниженная клеточность - повышенная (чрезмерно высокая) клеточность |
| Состав пунктата | - полиморфный - мономорфный - значительно разведен периферической кровью |
| Бласты | Количество и морфологическая характеристика (размер, форма клеток и ядер, соотношение ядра и цитоплазмы, характер хроматина, наличие нуклеол, цвет и зернистость цитоплазмы) |
| Гранулоцитарный росток | - сохранен - сужен (редуцирован) - расширен - морфологическая характеристика клеток (особенности морфологии, признаки дисплазии) |
| Созревание нейтрофилов | - не нарушено - задержано - ускорено |
| Другие лейкоцитарные ростки | Указывается количество и морфологическая характеристика клеток гиперплазированного ростка |
| Эритроидный росток | - сохранен - сужен (редуцирован) - расширен - морфологическая характеристика клеток (особенности морфологии, признаки дисплазии) |
| Тип эритропоэза | - нормобластический - мегалобластический |
| Гемоглобинизация | - не нарушена - ускорена - задержана: 1) на полихроматофильных формах; 2) на базофильных формах |
| Мегакариоциты в мазках | Указывается количество и морфологическая характеристика клеток (особенности морфологии, признаки дисплазии) |
| Клетки злокачественного новообразования (эпителиальной природы) | - обнаружены - не обнаружены |
|
|
|
По результатам подсчета клеточного состава, соотношения клеток костного мозга и их морфологических особенностей формулируют заключение, которое носит описательный, предположительный или окончательный характер (последнее возможно при обнаружении в пунктате характерной картины, а также при наличии необходимой клинической информации о пациенте).
5. Оценка правильности заключения (контроль качества цитологического исследования пунктата костного мозга)
Контроль качества цитологического исследования пунктата костного мозга выполняется путем участия в системе внешней оценке качества и внутрилабораторной оценке правильности заключения, которая должна осуществляться в лаборатории систематически. В настоящем стандарте приводятся несколько способов контроля качества исследования:
а) все пунктаты костного мозга одновременно исследуются двумя врачами, результаты сравниваются, обсуждаются возникшие расхождения оценки цитологической картины. Такой подход уменьшает вероятность ошибок, связанных с субъективными факторами;
б) принцип оценки правильности исследования состоит в следующем: в гематологической лаборатории исследуются контрольные мазки (препараты) костного мозга. Сравниваются результаты исследования контрольных мазков тестируемым сотрудником и контрольные результаты. При ошибочной интерпретации патологических изменений обсуждение цитоморфологической картины контрольного мазка проводится за микроскопом; в обсуждении участвуют отвечающий за качество исследований сотрудник и врач, проводивший исследование. При необходимости (сложный диагностический случай), в обсуждение включается заведующий лабораторией и все сотрудники лаборатории, осуществляющие исследование мазков из костномозгового пунктата;
в) катамнестический контроль правильности проводят путем сопоставления заключения гематологической лаборатории с диагнозами, установленными пациентам при дальнейшем клиническом обследовании:
1) при гистологическом исследовании костного мозга;
2) при анализе историй болезни за несколько лет - для выявления расхождений окончательного клинического диагноза и цитологического заключения.
|
|
|
