 |
Реакция связывания комплемента (РСК)
|
|
|
|
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:
1) серологической диагностики инфекционных заболеваний (р. Вассермана – при сифилисе, р. Борде–Жангу – при хронической гонорее и др.);
2) идентификации бактерии и др. микробов.
РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ и АТ, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем:
1) первая система – АГ+АТ+комплемент – обуславливает связывание комплемента в том случае если АТ соответствует АГ. В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;
вторая система (индикаторная) – гемолитеческая сыворотка (гемолизины) + эритроциты – показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т. к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент (см. прилож. 3, рис.7 и 8).
Компоненты реакции:
1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 0С в течение 30 минут);
2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);
3) комплемент;
4) гемолитическая сыворотка;
5) 3% взвесь эритроцитов барана;
6) физиологический раствор;
7) контрольная сыворотка.
Комплемент. В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
|
|
|
Титр комплемента – наибольшее разведение комплемента которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента – количество комплемента, которое выше тира на 25%.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50% взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 0С. Определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
РСК Борде –Жангу
Реакция ставится для диагностики хронической гонореи с целью обнаружения антител к гонококку.
В РСК участвует 2 системы: основная система – испытуемая сыворотка, антиген, комплемент и вспомогательная, индикаторная или гемолитическая система – гемолитическая сыворотка и эритроциты барана.
Если в первой системе образуются специфический комплекс антиген + антитело, то комплемент адсорбируется (соединяется с этим комплексом) и гемолиза во второй системе не происходит.
Для реакции требуется:
1. Испытуемая сыворотка, которая получается из крови, взятой пункцией локтевой вены больного. После свёртывания крови сыворотка отсасывается в отдельную пробирку и инактивируется 30 минут при 56 0С на водяной бане.
2. Антиген - взвесь убитых гонококков.
3. Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированной крови. Их отмывают, центрифугируя 3 раза с новыми порциями физиологического раствора. В реакции используют 3 % взвесь эритроцитов.
|
|
|
4. Гемолитическая сыворотка готовится заранее путём иммунизации кроликов эритроцитами барана. Перед употреблением производится титрование сыворотки.
5. Комплемент - свежая сыворотка морской свинки. Из сердца морской свинки шприцем насасывается кровь, после свёртывания отделяется сыворотка. Перед опытом вытитровывается рабочая доза комплемента. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 и разливают его по пробиркам, от 0,1 до 0,5, после чего объем в каждой пробирке доводят физиологическим раствором до 1,5 мл.
Одновременно заготавливают гемолитическую систему - разведенная в тройном титре гемолитическая сыворотка + 3 % взвесь эритроцитов барана. Оба ингредиента в разных объемах и выдерживают в термостате 30 минут (сенсибилизация смеси), после чего смесь добавляют по 1 мл в пробирки помещают в термостат на 30 минут. Контролем служат 3 пробирки:
1. 1мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора;
2. 0,5 мл комплемента 1:10 + 0,5 мл взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора.
Титром комплемента называется его минимальное количество, при котором ещё происходит гемолиз. Для постановления реакции берут рабочую дозу комплемента, увеличенную против титра на 20-25 % т. е., обычно то количество комплемента, которое имеется в предпоследней пробирке с гемолизом. Увеличение дозы комплемента необходимо потому, что в реакции активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами реакции (антиген, сыворотка).
Постановка основного опыта РСК Борде - Жангу.
В начале в 2 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 1-ю пробирку приливается антиген, во вторую физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляются рабочая доза комплемента.
После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 0С на 30 минут (горячее связывание). При холодном связывании штатив с пробирками помещается в ледник при температуре -40С на 18 часов. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система. Реакция ставится в объёме 0,5 мл. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, после чего производится предварительная регистрация результатов. Пробирки остаются при комнатной температуре, а на следующий день отмечается окончательный результат.
|
|
|
Степень интенсивности реакции оценивается в плюсах. Полная задержка гемолиза - четыре плюса (++++), неполная - три, и один плюс. Полный гемолиз обозначается минусами (-).
РСК Вассермана
Ставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения антител, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является неспецифичность антигена: в качестве антигена употребляют липоидные экстраты из нормальных органов животных.
Для постановки реакции Вассермана необходимо иметь сыворотку больного, диагностикумы перекрестнореагирующие антигены № 1 и № 2, комплемент, гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, физиологический раствор.
Диагностикум № 1 - специфический, трепонемный.
Диагностикум №2 - неспецифический, кардиолипиновый антиген, который представляют собой высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липоидов. Липоиды, экстрагированные из сердца, по химическому составу близки к липоидам бледной трепонемы, поэтому хотя и не являются специфическими, но фиксируют антитела против спирохеты. Указанные антигены выпускаются централизованно и в реакцию употребляются, разведёнными согласно к титру, указанному на этикетке.
Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и заведено положительной сыворотками.
|
|
|
