 |
Радиоиммунологический анализ (РИА)
|
|
|
|
В качестве метки используются радиактивные изотопы (131I, 125 I, или 3 H и 14 C).
В зависимости от техники постановки выделяют два способа РИА:
1) техника «жидкая фаза» (классический РИА).
Недостаток этой техники постановки – необходимость специального разделения свободного и связанного меченного антигенов (или антител).
2)техника «твёрдая фаза»
АГ или АТ известной специфичности связываются на сорбентах (твёрдой фазе) – стенках полистироловой лунке или пластиковой пробирки. На иммобилизованный АГ (АТ) последовательно сорбируются остальные компоненты ИК.
В зависимости от характера реакции различают следующие методы:
1 ) Конкурентный метод – метод, основанный на конкуренции антигенов (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антителами или антител (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антигенами.
Компоненты реакции:
а) определяемый АГ (исследуемый материал – кровь, мокрота и др.) или АТ (сыворотка крови);
б) идентичный к исследуемому АГ-у антиген или исследуемому АТ-у антитело, меченые радиоизотопом;
в) специфические АТ-ла или АГ-ны известной концентрации, связанные на сорбенте;
г) стандартный АГ или АТ (контрольный);
д) буферный раствор.
Сначала в реакцию вводят исследуемый АГ (или АТ). Происходит образование комплекса АГ-АТ на поверхности сорбента. Сорбент отмывают, затем вводят меченый АГ (или АТ). Чем больше содержание исследуемого АГ (или АТ), тем меньше меченного АГ (или АТ) связывается с АТ-м (АГ-м) на поверхности сорбента. Концентрацию меченного АГ (или АТ) определяют измерением радиоактивности реакции с помощью счетчиков. Величина радиоактивности реакции будет обратно пропорциональной количеству АГ (АТ) в исследуемой пробе.
|
|
|
2) Неконкурентный метод.
Компоненты реакции:
а) определяемый АГ;
б) специфические АТ-а известной концентрации, связанные на сорбенте;
в) идентичные к связанному антителу антитела, меченые радиоизотопом;
г) стандартный АГ;
д) буферный раствор.
К связанным АТ добавляют исследуемый АГ. В процессе инкубации на сорбенте образуются комплексы АГ-АТ. Сорбент отмывают от свободных компонентов и добавляют меченые АТ, которые связываются со свободными валентностями АГ-на в составе комплекса. Величина радиоактивности пропорциональна концентрации исследуемого АГ.
3) «Сэндвич-метод» (непрямой метод) – наиболее распространённый метод.
Компоненты:
а) исследуемая сыворотка (или исследуемый АГ);
б) АГ-ы, связанные на сорбенте (или АТ-ла, связанные на сорбенте при определении АГ).
в) диагностические АТ против иммуноглобулинов, меченные радиоизотопами;
г) контрольные сыворотки (или АГ-ы)
д) буферные растворы
Исследуемые АТ-а (или АГ-ы) реагируют с твёрдофазными АГ-ми (АТ-ми), после чего инкубат удаляется и в реакцию вводят меченые антиглобулиновые АТ, которые связываются со специфическими комплексами АГ- АТ на поверхности сорбента. Величина радиоактивности реакции прямо пропорциональна количеству исследуемого АТ (или АГ).
Достоинства РИА:
1) высокая специфичность и чувствительность
2) простота техники постановки
3) точность количественной оценки результатов.
4) легко поддаётся автоматизации
Недостаток: использование радиоактивных изотопов.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.
Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина.
|
|
|
Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (см. прилож.3, рис.11 и 12).
Сущность ИФА аналогична РИА.
Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.
К преимуществам ИФА следует отнести:
- отсутствие контакта с радиоактивными веществами;
- простота методов оценки реакции;
- стабильность конъюгатов;
- легко поддаётся автоматизации.
Однако по сравнению с РИА отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.
В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:
Конкурентный тип.
Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определение носительства HBs Ag.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;
2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;
3) конъюгат – мышиные моноклониальные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой
4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат
5) фосфатно – солевой буфер
6) контрольные сыворотки:
- положительная (сыворотка с HBs Ag)
- отрицательная (сыворотка без HBs Ag).
Ход работы.
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.
2) Инкубация 1 час при 370 С
3) Отмывание лунок.
4) Внесение конъюгата
5) Инкубация 1 час при 370 С
6) Отмывание лунок.
7) Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.
Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.
Механизм.
Реакция протекает в три фазы:
1) HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ - АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).
2) Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ-HBs Ag-anti HBs АТ, меченые пероксидазой).
3) ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.
Непрямой тип.
Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.
Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.
|
|
|
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ)
2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки
3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ-м).
4) ОФД
5) фосфатно-солевой буфер
6) контрольные сыворотки:
- положительная
- отрицательная
Ход работы.
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток
2) Инкубация 30 минут при 370 С
3) Отмывание
4) Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом
5) Инкубация 30 минут при 370 С
6) Отмывание
7) Внесение ОФД
Механизм.
Реакция протекает в 3 фазы:
1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ (АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ)
2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки
3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.
|
|
|
