Главная | Обратная связь
МегаЛекции

Краткое теоретическое введение





Занятие 10

Методология химико-токсикологического анализа

 

Структура занятия:

I. Входной тест

II. Семинар «Методология проведения химико-токсикологического анализа (ХТА). Направленный и ненаправленный ХТА. Вещественные доказательства. Методы подготовки вещественных доказательств для анализа. Основные этапы проведения ХТА».

III. Лабораторная работа «Пробоподготовка и анализ вещественных доказательств отравления».

Целевые задачи:

- Научиться составлять план химико-токсикологического исследования

- Изучить стадии пробоподготовки биоматериалов

- Изучить структуру документов, которые заполняются при проведении ХТА

- Оформить акт/заключение эксперта-химика по результатам химико-токсикологического исследования вещественных доказательств.

Краткое теоретическое введение

 

Химико-токсикологические исследования при отравлении токсическими веществами и их метаболитами (алкоголем и его суррогатами, наркотическими средствами, психотропными лекарственными средствами, органическими растворителями и другими веществами, вызывающими интоксикацию, включая токсичные метаболиты) проводятся в несколько этапов: отбор, транспортировка/хранение биологических объектов; подготовка образцов для анализа; качественный и количественный анализ.

Кровь для проведения химико-токсикологических исследований отбирается (Приложение 10.1) из поверхностной вены одним из следующих способов:

-самотеком в сухой флакон с раствором гепарина (3-5 капель на каждые 10 мл крови). Отбирается 15 мл крови в два флакона объемами 10 и 5 мл. Флаконы закрываются стандартной резиновой пробкой, которая фиксируется алюминиевым колпачком. Содержимое флаконов сразу же перемешивается. Флаконы опечатываются и направляются в ХТЛ для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов. Флакон с 5 мл крови хранится как контрольный образец. Второй флакон с 10 мл крови (анализируемый образец) используется для проведения химико-токсикологических исследований;



- с использованием вакуумных пробирок (одноразовых устройств для ускоренного взятия крови с содержанием гепарина и иглами с двух концов) один конец вводится в вену, другим концом прокалывается резиновая мембрана пробирки. Отбирается 15 мл крови в две вакуумные пробирки по 5 мл и 10 мл (контрольный и анализируемый образцы), пробирки опечатываются. Для химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов обеспечивается доставка образцов крови в ХТЛ не позднее двух суток после отбора. Кровь после отбора до момента отправки в ХТЛ хранится в холодильнике при температуре 0-2°С.

Кровь с сопроводительной документацией направляется в ХТЛ в укупоренных и опечатанных флаконах, вакуумных пробирках в специальном контейнере в сумке-холодильнике на транспорте медицинской организации в сопровождении медицинского работника, ответственного за доставку биологических объектов.

Отбор мочи производится в условиях, исключающих возможность замены или фальсификации биологического объекта (при освидетельствовании наркотического или алкогольного отравления). Моча собирается в стеклянный или пластмассовый градуированный сосуд с широким горлом объемом до 200 мл в количестве до 100 мл, но не менее 30 мл. Сосуд с мочой передается медицинскому персоналу; его накрывают покровной пластиной (крышкой). В течение первых 5 мин проводится предварительное исследование мочи, включающее определение следующих показателей:

температуры стеклянным ртутным термометром (норма 32,5-37,7°С); рН с помощью универсальной индикаторной бумаги для определения рН мочи (норма рН= 4-8); относительной плотности (норма ρ=1.008-1.025 г/см3); содержания креатинина методом иммунной хроматографии (норма 4,4 - 17,7 ммоль/сут).

Если при предварительном исследовании выявляется несоответствие указанных в настоящем пункте показателей их нормам, проводится повторный отбор мочи. Результаты предварительного исследования фиксируются в соответствующей графе Журнала регистрации отбора биологических объектов (Приложение 10.2).

После проведения предварительных исследований мочу делят на две части (1/3 и 2/3 общего объема) и помещают их в два стеклянных или пластмассовых герметично закрывающихся контейнера объемом 100 мл каждый. Первый контейнер с меньшим количеством мочи хранится как контрольный образец. Второй (анализируемый образец) используется для проведения химико-токсикологических исследований.

При направлении мочи для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя, его суррогатов и метаболитов, моча после разделения отбирается из контейнера с анализируемым образцом в чистый сухой флакон объемом 10 мл в количестве не менее 5 мл, закрывается резиновой пробкой, фиксируется алюминиевым колпачком и укупоривается под обкатку.

Для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов моча доставляется в ХТЛ не позднее двух суток после отбора, до отправки в ХТЛ моча хранится в холодильнике при температуре 0-2°С.

Отобранная моча с сопроводительной документацией доставляется в ХТЛ в укупоренных и опечатанных контейнерах в сумке-холодильнике на транспорте медицинской организации медицинским работником, ответственным за доставку биологических объектов.

При отборе волос их срезают ближе к коже ножницами с закругленными концами отдельно с лобной, теменной, затылочной, правой и левой височных областей волосистой части головы. При невозможности отбора волос с волосистой части головы (облысение), волосы срезаются с подмышечных впадин или лобковой области. Для проведения химико-токсикологических исследований отбирается не менее 300 мг волос. Отобранные образцы волос делятся на две равные части, заворачиваются в фольгу, каждая часть помещается в отдельный конверт с соответствующими надписями: контрольный и анализируемый образцы. Конверты опечатываются и хранятся в сухом месте при температуре 20-25°С до отправки в ХТЛ.

Для отобранных биологических объектов готовятся две этикетки, одна из которых предназначена для контрольного образца, другая для анализируемого. На этикетках указывается штрих-код либо шестизначный код освидетельствуемого (для кодирования используется произвольный ряд чисел от 0 до 9, например: 003841, 658097 и т.д.), дата и код подразделения медицинской организации, в которой производится отбор биологических объектов. На этикетке контрольного образца после шестизначного кода либо штрих-кода освидетельствуемого ставится буква "К" (например: 003841-К). Обратная сторона этикеток подписывается освидетельствуемым до указания на этикетках его штрих-кода либо шестизначного кода. Каждая этикетка крепится к флакону (пробирке, контейнеру и пр.) клейкой лентой таким образом, что бы исключить возможность подмены содержимого флакона без нарушения целостности этикетки. Место соединения концов ленты пломбируется и опечатывается с использованием штампа структурного подразделения медицинской организации, в которой проводился отбор биологических объектов. Подготовленные биологические объекты упаковываются в контейнер и с сопроводительной документацией помещаются в сумку-холодильник.

Контрольные образцы биологических объектов при поступлении в ХТЛ сразу же помещаются на хранение в запираемые или опечатываемые холодильные шкафы и хранятся при температуре не выше -18°С. Срок хранения контрольного образца - 2 мес со дня поступления в ХТЛ. Если в течение этого срока отсутствовала необходимость в повторных химико-токсикологических исследованиях, то по истечении 2-х месяцев контрольный образец биологического объекта уничтожается. Анализируемые образцы биологических объектов при поступлении в ХТЛ хранятся в течение первых двух суток при температуре 0 - 2°С, далее - при температуре не выше -18°С в запираемых или опечатываемых холодильных шкафах.

Правила проведения химико-токсикологического анализа включают обязательное оформление специального документа – Направления на химико-токсикологические исследования (Приложение 10.3). В этом документе следует сообщать максимум подробностей: наименование медицинской организации и его структурного подразделения, выдавшего направление; фамилию, имя, отчество освидетельствуемого или пострадавшего и его возраст; дату и время отбора пробы и условия ее хранения; дату отправки биологических объектов в ХТЛ предварительный клинический диагноз; цель химико-токсикологических исследований. Следует обратить внимание химика-токсиколога на обнаружение какого вещества (лекарственного средства) или группы веществ требуется провести исследования в первую очередь

Справка о доставке биологических объектов на химико-токсикологические исследования подписывается руководителем ХТЛ. В справке указываются результаты осмотра биологических объектов заведующим ХТЛ, дата и время их доставки, и в случае несоответствия упаковки, несоблюдении условий хранения биологических объектов после отбора и при их транспортировке, при неправильном оформлении сопроводительной документации выявленные несоответствия фиксируются в соответствующем разделе.(Приложение 10.4).

 

План химико-токсикологического анализа определяется предварительным клиническим диагнозом или направлением врача скорой помощи. При судебно-химическом исследовании химик-эксперт ориентируется в первую очередь на материалы дела, изложенные в постановлении органов дознания. Кроме того, во внимание принимаются данные других сопроводительных документов − выписки из истории болезни, акта вскрытия трупа и др.

Осмотр и описание вещественных доказательств отравления.Следует иметь в виду, что объекты ХТА предстапвляют большую ценность для судебно-следственных органов, судебных медиков, врачей-токсикологов Объекты ХТА отбираются для анализа на определенной стадии отравления, например, наскрытой или токсикогенной и поэтому представляют собой единичные экземпляры. Желудок, печень, почка, кровь, моча и любой другой трупный материал, также кровь, моча, рвотные массы, промывные воды желудка погтерпевшего не могут быть взяты для анализа повторно, на той же стадии отравления или в тот же момент после гибели человека. Для проведения судебно-химической экспертизы должно расходоваться не более 1/3 объекта, вторая треть материала может быть израсходована (при необходимости) для проверочного исследования и уточнения количественного определения. Оставшуюся треть материала необходимо вернуть в учреждение, направившее материал на судебно-химическое исследование, или хранить в соответствии с Приказом МЗ РФ от 24 апреля 2003 г № 161.

Как уже отмечалось, в химико-токсикологической лаборатории обязательно ведение журнала регистрации ХТА (см. Приложение 10.2). Журнал является юридическим документом. Страницы журнала должны быть пронумерованы и прошнурованы. В журнале отражается следующая информация: название, номер и дата сопроводительного документа к поступившему на анализ образцу; дата, номер анализа, фамилия и инициалы потерпевшего (освидетельствуемого); номер истории болезни; предполагаемый диагноз; название отделения лечебного учреждения; описание объекта исследования; цель исследования; время начала и окончания анализа; метод исследования; результат проведенного анализа; подпись химика-эксперта, выполнявшего анализ.При осмотре поступивших на анализ проб указывают растворитель (консервант), в который помещен доставленный образец; описывают внешний вид, фазовое состояние (кристаллическое, аморфное, жидкое), цвет, запах, вязкость, летучесть. При хранении пробы в консерванте дополнительно должна прилагаться его проба. Консервация формалином, глицерином, фенолом и другими веществами рассматривается как «преступная» халатность. Такое вещество, как формалин, само является ядом и входит в круг химического исследования при отравлениях. Кроме того, формальдегид вступает в реакции с такимитоксикантами, как аммиак и циановодорродная кислота; затрудняет обнаружение метанола (идентификация метанола включает реакцию превращения его в формальдегид) и ряда других веществ. При обнаружении неправильно выбранного консерванта необходимо составить акт с указанием его возможного влияния на результат химического анализа. Акт пересылают в организацию, направившую объекты в химическую лабораторию.

При описании запаха принимают во внимание, что специфический запах имеют ментол, метилсалицилат, камфора, ксероформ, некоторые витамины, формалин, бензин, керосин, ароматические и хлорированные углеводороды, эфиры этиленгликоля, солод и другие вещества. Для фенолов характерен специфический «фенольный» запах. Ацетон, хлороформ имеют«сладковатый» запах. Для алифатических спиртов характерен спиртовой, а для их эфиров – фруктовый запах. Кислоты - азотная, соляная, хлорная, уксусная, трихлоруксусная, муравьиная вызывают раздражение слизистой оболочки дыхательных путей. Гидриды фосфора теллура, мышьяка и других p-элементов имеют чесночный запах.

Фиалковый запах мочи наблюдается при отравлении скипидаром. Запах ацетона - при отравлении изопропанолом, ацетоном. Следует помнить, что запах ацетона характерен для мочи больных сахарным диабетом.

Окраска исследуемого объекта также помогает в предварительной идентификации вещества, вызвавшего отравление. Вещественные доказательства желтого цвета – это производные нитрофурана, нифедипин, но-шпа, нистатин, меркаптопурин, антибиотики группы тетрациклина, тавегил, леворин, риванол, пикриновая кислота и др. Желто-оранжевую окраску имеют витамин В2, фолиевая кислота, калия дихромат. Желто-зеленая окраска характерна для рутина, зеленая - для бриллиантового зеленого, для кобаламина – розовая, рубомицина - красного. Красный цвет с коричневатым оттенком характерен для ферроцерона. Калия перманганат имеет красно-фиолетовую окраску. Кристаллы йода окрашены в темно-фиолетовый цвет с характерным металлическим блеском, растворы йода имеют темно-коричневую окраску.

В ходе визуального осмотра содержимого желудка отмечают его цвет. Пурпурная или розовая окраска содержимого может быть связана с отравлением перманганатом калия. При отравлении солями меди содержимое желудка пострадавшего окрашено в зеленый или голубой цвет, солями никеля – в зеленый, солями кобальта — в розовый цвет. Окрашивание содержимого желудка в желтый цвет позволяет предположить отравление азотной или пикриновой кислотой. Кислоты серная, соляная, щавелевая придают исследуемому материалу цвет кофейной гущи, а йод — сине-коричневое окрашивание.

Красно-коричневый цветмоча имеет при отравлении производными пиразола, фенотиазина. Фенол и метиленовая синь меняют цвет мочи на зелено-синий, а фенацетин, рибофлавин, производные нитрофурана, пикриновая кислота — на желтый.

После визуального осмотра мочи проводят предварительные хромогенные реакции (цветные тесты) с отдельными ее порциями (Приложение 10.5). В случае отрицательного результата дальнейшее исследование на необнаруженные группы токсикантов не проводят.

Необходимо отметить, что, кроме лекарственных веществ, в некоторые лекарственные формы входят вспомогательные вещества, консерванты, стабилизаторы. Они могут мешать определению основныхтоксикантов, что иногда приводит к ошибочным заключениям.

Подготовка биопробы к анализу.Идентификации токсиканта (качественному анализу) и его количественному определению предшествует пробоподготовка, включающаяизолирование (извлечение) яда, отделение мешающих проведению анализа компонентов биопробы, концентрирование определяемых веществ. При проведении ХТА возникают трудности, связанные с низким содержанием определяемого вещества на фоне большого количества эндогенных веществ – белков, пептидов, липидов, углеводов, стероидов, пигментов и др. Поэтому основная задача этого этапа анализа - снизить до минимума содержание фоновых веществ и добиться максимально возможного концентрирования определяемых веществ.

Пробоподготовка является наиболее трудоемким этапом анализа и содержит главные источники ошибок его результат. Пробоподготовка должна выполняться очень аккуратно и последовательно с учетом дальнейшего метода идентификации и количественного определения яда.

Пробоподготовка тканей различных органов включает несколько стадий. Полученные для анализа почка, части печени, мозга, кишки, лоскуты кожи и др. необходимо измельчить. Измельчение до размера частиц 0,5-2 см2можно проводить ножницами; растиранием в ступке с песком, стеклом, солями; с помощью ножевых гомогенизаторов или современных высокоскоростных турбин - ультратураксов. Обработка биоматериалов ультразвуком приводит к разрушению структурной целостности клеток и их мембранных структур.

Лиофилизация, или обезвоживание, проводится с использованием обезвоживающих веществ (натрия сульфата, гипса) под вакуумом в эксикаторах или с помощью лиофильных сушек (сублимационное высушивание замороженного материала под вакуумом). Замораживаниеосуществляется при температуре -5÷-15ºС.

Депротеинирование биоматериала, удаление белков, возможно при обработке его этанолом (абсолютным или 96%) – фрагмент метода Стаса=Отто, органическими растворителями (ацетоном или ацетонитрилом) – фрагмент «ацетонового метода», кислотами (соляной, хлорной, трихлоруксусной и др.), солями (вольфроматами, сульфатами, нитратами, фосфатами, хлоридамии др.). Возможно проведение ферментативногодепротеинирования.

Удаление липидов из биоматериалапроводятэкстракцией органическими растворителями, методом колоночной хроматографии или препаративной ТСХ; сепарацией липидов, вымораживанием исследуемых образцов.

Таким образом, при пробоподготовке достигается нарушение целостности ткани и клеточных структур, обеспечивается обезвоживание, отделение белков и липидов, что приводит к последующему более полному изолированию определяемых веществ и их концентрированию в анализируемой пробе. Эти предварительные операции снижают нижние пределы определения и количественной оценки (занятие 11) токсичного вещества в биопробе.

Изолирование токсического вещества из биоматериала чаще всего проводят жидкостной экстракцией. Теоретические основы этого метода подробно рассмотрены в Учебнике (с. 62-74, 162-167) и Практикуме (занятие 5). Распределение токсического вещества между двумя фазами в первую очередь зависит от его липофильности/гидрофильности, определяемой степенью ионизации, являющейся функцией рН жидких фаз. Количественно жидкость-жидкостная экстракция может быть оценена коэффициентом распределения ксенобиотика между органической и водной фазами. Именно поэтому в химико-токсикологическом и судебно-химическом анализе традиционно используют многостадийную экстракцию органическими растворителями токсикантов кислотной и основной природы при различных значениях рН, с последующей реэкстракцией водными растворами с низкими и высокими значениями рН.

Например, при жидкость-жидкостной экстракции мочи для изолирования предположительно содержащихся в ней соединений с гетероциклическим атомом азота (органические основания), отдельные ее порции смешивают с органическими растворителями при разных значениях рН среды. Щелочное извлечение исследуют на наличие ксенобиотиков основной природы - производных 1,4=бензодиазепина, морфина, кодеина и др. Полученные экстракты испаряют на часовых стеклах. Сухие остатки рассматривают визуально и под микроскопом. Каждый из остатков исследуют методом хроматографии в тонком слое (ТСХ), в том числе в системах, предложенных Международным комитетом по систематическому токсикологическому анализу; выполняют цветные тесты; проводят анализ с использованием спектральных методов.

Для определения летучих ядов, например, органических растворителей, применяют парофазную экстракцию – перевод определяемого вещества в газовую фазу. Такой метод изолирования применяется при использовании метода ГЖХ. Широкое распространение получил метод твердофазной экстракции – адсорбции токсического вещества на твердом сорбенте с последующим элюированием растворителем (рис. 10. 1). Развитие этого метода достигло такого совершенства, что позволяет разделять на специфических сорбентах энантиомеры органических веществ, в том числе лекарственных, отличающиеся по своим биологическим эффектам.

 

 

Рис. 10.1. Современные типы хроматографических колонок - а и селекторов (адсорбентов) –б, используемых при разделении и анализе энантиомерных смесей.(Плетенева Т.В., Сыроешкин А.В., Гармонов С.Ю. и др. Итоги 15-ого Междунарождного симпозиума «Фармацевтический и биомедицинский анализ».- Химико-фармацевтический журнал.- т.39.- №8.- 2005)

 

В качестве вещественных доказательств в химико-токсикологическую лабораторию могут быть также направлены таблетки лекарственных веществ, растения, порошки и жидкости неизвестного происхождения. Правила их осмотра, подготовки для анализа, предварительные аналитические тесты, рекомендуемые методы анализа представлены в Приложении 10.6.

Регистрация и документальное оформление результатов ХТА.После проведения химико-токсикологических исследований оформляется "Справка о результатах химико-токсикологических исследований" (Приложение 10.7.). Она готовится специалистом ХТЛ, проводившим химико-токсикологические исследования. В справке указывают наименование химико-токсикологической лаборатории; номер химико-токсикологического исследования, соответствующий номеру, зарегистрированному в «Журнале регистрации результатов химико-токсикологических исследований»; дата проведения исследований, фамилия и инициалы специалиста ХТЛ, проводившего химико-токсикологические исследования; номер направления на химико-токсикологические исследования с датой его выдачи и наименованием структурного подразделения медицинской организации, производившего отбор биологического объекта и выдавшего направление; фамилия и инициалы освидетельствуемого или пострадавшего и его возраст. В строке "Методы исследования" указывают использованные предварительные методы (иммунохроматографический, иммуноферментный, поляризационный флуороиммуноанализ, тонкослойная хроматография) и подтверждающие методы (спектральные, хроматографические: специализированные системы для обнаружения опиатов, каннабиноидов, бензодиазепинов на основе тонкослойной хроматографии, газожидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, хроматомасс-спектрометрия). Не допускается указание названий методов в сокращениях. Необходимо указать тип биологического объекта (кровь, моча, слюна и др.). При обнаружении алкоголя, его суррогатов, наркотических средств (групп средств), психотропных и других токсических веществ (групп веществ) и их метаболитов указывается наименование обнаруженных веществ (средств), их массовая концентрация в мкг/мл), мкг/г, мг/ мл.

Если искомые вещества не обнаружены, делается запись, что указанные в направлении вещества (средства) не обнаружены (на уровне предела обнаружения). При положительных результатах химико-токсикологических исследований предварительными методами проводится их подтверждение одним или двумя подтверждающими методами. При отрицательных результатах подтверждающих методов делается запись, что указанные в направлении вещества (средства) не обнаружены на уровне предела обнаружения используемого метода.

При положительных результатах подтверждающих методов делается запись, что указанные в направлении вещества (средства) обнаружены на уровне предела обнаружения используемых методов, а при необходимости указывается и их концентрация.

Результаты проведенного исследования оформляют на бланке «Акта судебно-химического исследования» (см. Приложение 1.5), если материалы на экспертизу направлял судебно-медицинский эксперт. Если экспертиза проводилась на основании постановления органов дознания то составляется «Заключение эксперта». В этих документах, как и в "Справке о результатах химико-токсикологических исследований" (см. Приложение 10.4) указывают номер анализа; фамилию и инициалы потерпевшего (освидетельствуемого); вид доставленного на анализ объекта (кровь, моча и т.д.); дату и время доставки объекта; цель исследования; заключение по результатам исследования; подпись химика-эксперта, выполнявшего анализ; даты выполнения анализа и составления документа.

 

I.Примеры вопросов входного теста:





Рекомендуемые страницы:

Воспользуйтесь поиском по сайту:
©2015- 2019 megalektsii.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав.