 |
Инсулин – первый генно-инженерный медицинский препарат
|
|
|
|
Контрольные вопросы
1. Этапы клонирования
2. Виды плазмид
3. Какие ферменты необходимы для метода генной инженерии?
Лекция 5
Инсулин – первый генно-инженерный медицинский препарат
Форма проведения лекции: проблемная лекция
План лекции
1. Инсулин – первый генно-инженерный медицинский препарат, его терапевтические свойства.
2. История открытия и синтеза инсулина.
3. Использование генной инженерии для получения рекомбинантного инсулина.
1. Инсулин синтезируется b-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы; 70 % мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно этот белок.
Человеческий инсулин- полипептид с м. м. 5808, состоящий из 51-й аминокислоты, которые образуют две соединенные дисульфидными мостиками полипептидные цепи (одна цепь состоит из 21 аминокислоты, так называемая цепь А; другая – из 30 аминокислотных остатков, так называемая цепь В). Аминокислотный состав цепей видоспецифичен. Предшественник инсулина продуцируется внутри b-клеток посредством ДНК и РНК-управляемого синтеза. Длинная цепь проинсулина в аппарате Гольджи упаковывается в гранулы, где в результате гидролиза удаляются четыре аминокислоты с образованием инсулина и связывающего пигмента, называемого С-пептидом. Инсулин и С-пептид в эквивалентных концентрациях секретируются в ответ на все стимуляторы секреции инсулина (глюкозу, маннозу и некоторые аминокислоты – лейцин, аргинин). Выделяется также небольшое количество нативного или частично гидролизованного инсулина, который оказывает некоторое гипогликемическое действие. В гранулах b-клеток инсулин депонируется в виде кристаллов, состоящих из двух атомов цинка и шести молекул инсулина. В целом, человеческая поджелудочная железа содержит до 8 мг инсулина, что составляет приблизительно 200 биологических «единиц» (количество единиц определяют по массе препарата; существующий инсулиновый стандарт, используемый в аналитических целях, составляет 28 Ед/мг).
|
|
|
Инсулин обладает мощным действием, охватывающим биосинтез НК, белков, обмен углеводов, липидов, продукцию высокоэнергетических соединений. Инсулин регулирует углеводный обмен, усиливает усвоение тканями глюкозы и способствует превращению ее в гликоген, облегчает проникновение глюкозы в клетки тканей. Будучи специфическим средством терапии сахарного диабета, инсулин снижает гипергликемию и глюкозурию, пополняет депо гликогена в мышцах и печени, уменьшает образование глюкозы, снимает диабетическую липемию, улучшает общее состояние больного. Единственное отличие больного человека от здорового в том, что здоровые получают этот гормон благодаря собственной поджелудочной железе, больные – из рук государства.
Сахарным диабетом 1 типа – инсулинзависимым диабетом (ИЗСД) – официально больны свыше 3 млн российских граждан, «неофициально» - до 10 млн. Известно, что ИЗСД (тяжелая форма, при отсутствии лечения приводящая к кетозу), наряду с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями занимает одно из ведущих мест по медико-социальной значимости и является причиной ранней инвалидности и высокой смертности. Диабет 2 типа – инсулиннезависимый (ИНЗСД) включает легкие формы диабета. Диабетом этого типа чаще болеют тучные люди.
2. История открытия инсулина связана с именем русского врача И. М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.
В 1922 г. инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен 10-летнему мальчику (Торонто), больному диабетом. Результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина. Поджелудочная железа крупного рогатого скота (КРС) и свиней поставляется бойнями, где опытный персонал по разработанной методике извлекает железы из туш, их быстро замораживают (оптимальная температура – 70о С) и в вагонах-рефрежераторах направляют на фармацевтические предприятия, где экстрагируют гормон. Масса поджелудочной железы КРС составляет в среднем 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 1000-1200 кг исходного сырья. Бычий (говяжий) гормон, в отличие от свиного, обладает несколько большей антигенностью для человека. После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огромный путь его выделения и очистки, в результате гормон стал доступен для лечения больных сахарным диабетом 1 типа. Для адекватного контроля уровня глюкозы в крови инсулин нужно было вводить подкожно 4 раза в сутки.
|
|
|
В 1935 г. датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат - протамин-цинк-инсулин (вводил один раз в сутки).
Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 г.; развитие методов очистки гормона (иммуноэлектрофорез, ВЭЖХ) от других гормональных веществ (глюкагона – антагониста инсулина и соматостатина, последний подавляет выделение инсулина и глюкагона) и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентными.
В 1954 г. английский биохимик Г. Сенджер получил Нобелевскую премию за расшифровку структуры инсулина.
Синтез обеих цепей инсулина и соединение их дисульфидными связями был проведен в 1963-1965 гг. В начале 70-х годов советскими учеными А. Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина. Осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез полипептидного гормона, состоящего из десятков аминокислотных остатков, нерентабельно, в том числе и по причине малого выхода.
В 70-е гг. 20 в. шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшило проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Со времени открытия и до начала 80-х гг. использовали инсулин, получаемый из поджелудочной железы КРС и свиней. Инсулин КРС отличается тремя аминокислотами, свиной - одной аминокислотой от инсулина человека. Наиболее эффективный гормон для заместителей терапии при сахарном диабете – гомологичный инсулин, т. е. инсулин человека.
|
|
|
В 1980 г. датская фармацевтическая компания «Novo» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением аланина, последний является 30-й аминокислотой в цепи В, на остаток треонина с последующей хроматографической очисткой продукта, в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 % чистоты.
3. Достижения молекулярной биологии позволили установить, что биосинтез инсулина в b-клетках островковой ткани происходит по следующим основным этапам:
- закодированная информация о структуре гормона содержится в инсулиновом гене (участок ДНК) 11-й хромосомы;
- в результате стимулирующего действия, прежде всего глюкозы и некоторых других веществ, эта информация списывается РНК-полимеразой с инсулинового гена в виде мРНК на рибосомах, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков. На рибосомах происходит сборка полипептидной цепи из 109 аминокислот с образованием препроинсулина под влиянием рестриктаз, в результате образуются фрагменты от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов;
- при синтезе препроинсулина в b-клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты «проводят» молекулу через мембрану клетки. Эти аминокислоты отщепляются рестриктазами и образуется пептид проинсулин, состоящий из 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный ее сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется под влиянием ферментов рестрикции; роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина.
|
|
|
Использование аффинной хроматографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м. м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител. Стандартизация инсулина по загрязнению классифицирует препараты на обычные, содержащие проинсулина более 1 %, монопиковые – менее 0, 3 %, улучшенные монопиковые – менее 0, 005 % и многокомпонентные, содержащие менее 0, 001 % проинсулина.
Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Наиболее частые осложнения инсулиновой терапии – гипогликемические состояния, основными признаками избытка инсулина являются нарушения функции ЦНС (спутанность сознания, странное поведение, кома).
Компания «Eli Lilly» в массовом производстве человеческого инсулина использует технологию рекомбинантных ДНК, помещая кДНК гена человеческого проинсулина в E. coli или S. serevisae и гидролизуя наработанный проинсулин до молекулы инсулина. Человеческие инсулины этой фирмы носят название «Хумулин». В медицинской практике используют рекомбинантные человеческие инсулины из серии Хумулин – регулярный, ленте, ультраленте и их комбинированные составы. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.
В молекуле инсулина обнаружены области, играющие повышенную роль в его физико-химических и биологических свойствах. При внесении мутационных изменений в аминокислотную последовательность этих областей, существенным образом изменяются свойства молекулы в целом. Удалось получить аналоги с модификацией В-цепи, что привело к значительному увеличению гормональной активности по сравнению с природным инсулином.
Контроль качества генноинженерного инсулина предполагает контроль дополнительных показателей, характеризующих стабильность рекомбинантного штамма и плазмиды, отсутствие постороннего генетического материала в препарате, идентичность экспрессируемого гена и др. (всего 22 показателя).
|
|
|
