 |
Инсулин – первый генно-инженерный медицинский препарат
|
|
|
|
Контрольные вопросы
1. Какова роль биообъекта в биотехнологическом производстве?
2. Что может быть использовано в качестве биообъектов в биотехнологии?
3. Какие свойства биообъекта можно использовать для его совершенствования в целях создания эффективного и безопасного производства лекарственных средств?
Лекция 6
Инсулин – первый генно-инженерный медицинский препарат
Форма проведения лекции: проблемная лекция
План лекции
1. Схема получения биотехнологическим способом инсулина
2. Физиологические аспекты инсулина, механизмы действия.
1. В Великобритании с помощью E. coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, т. е. ввести ему ген гормона. Химическим способом (операцию проводят специалисты биохимики) получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина. Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или гены цепей инсулина порознь) в геном E. coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях; эту задачу выполняет генная инженерия. Из E. coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. Синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функциональной активной С-концевой частью b-галактозидазы E. coli). В результате E. coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят их очистку. В бактериях синтезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку (рис. 2).
|
|
|
Природа гормонального вещества, продуцируемого E. coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препептида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин. Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химико-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фронтальной, гель-проникающей, анионообменной).
В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E. coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40 % от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivo – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хроматографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой частоты и природной активности.
Рисунок 2. Схема получения биотехнологическим способом инсулина
2. В н. в. в медицинской практике используют инсулины трех типов:
- короткодействующие с быстрым началом эффекта;
- средней продолжительности действия;
- длительного действия с медленным проявлением эффекта.
Инсулин короткого действия - регулярный инсулин – представляет собой короткодействующий растворимый при нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в течение 15 минут после подкожного введения и продолжается 5-7 ч.
|
|
|
С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении в нейтральной среде образуют суспензию. Они содержат протамин в фосфатном буфере – протамин-цинк-инсулин и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) – НПХ – инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере – инсулины ультраленте, ленте, семиленте.
Препараты инсулина средней длительности действия содержат протамин, представляющий белок средней м. м. 4400, богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1: 10. После подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, позволяя инсулину всасываться.
НПХ-инсулин не изменяет фармакокинетический профиль смешиваемого с ним регулярного инсулина. НПХ-инсулин предпочтительнее инсулина ленте в качестве компонента средней длительности действия в терапевтических смесях, содержащих регулярный инсулин.
В фосфатном буфере все инсулины (свиной, бычий, человеческий) легко образуют кристаллы с цинком, но только кристаллы бычьего инсулина обладает достаточной гидрофобностью, чтобы обеспечить замедленное и стабильное высвобождение инсулина, характерного для ультраленте. Цинковые кристаллы свиного инсулина растворяются быстрее, эффект наступает раньше, длительность действия короче. Поэтому не существует препарата ультраленте, содержащего только свиной инсулин. Монокомпонентный свиной инсулин выпускают под названием инсулин-суспензия, инсулан-нейтрал, инсулин-изофан, инсулин-аминохинурид.
Инсулин ленте – это смесь 30 % инсулина семиленте (аморфный преципитат инсулина с ионами цинка в ацетатном буфере, эффект которого развеивается относительно быстро) с 70% инсулина ультраленте (плохо растворимый кристаллический цинк-инсулин, имеющий замедленное начало и пролонгированное действие). Эти два компонента обеспечивают комбинацию с относительно быстрой абсорбцией и стабильным длительным действием, делая инсулин-ленте удобным терапевтическим средством. При введении инсулина в виде аэрозоля на слизистую оболочку носа эффективный уровень препарата в плазме достигается быстро, однако, длительное интраназальное введение инсулина оказывает токсическое действие на слизистую оболочку.
|
|
|
