Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Технология рекомбинантных ДНК, или генная инженерия




Контрольные вопросы

4. Что означает репарация биообъекта для биотехнологического производства лекарственных препаратов?

5. В чем заключается принципиальное отличие методов клеточной инженерии от генной?

6. Что является ключевым моментом в создании новых рекомбинантных структур?

       

Лекция 7

Технология рекомбинантных ДНК, или генная инженерия

Форма проведения лекции: обзорная лекция, мозговая атака

План лекции

1. Методы иммунного ответа: интерфероны, лимфокины и монокины (интерлейкины); фактор некроза опухолей.

2. Механизмы действия, функциональные аспекты, получение с помощью генно-инженерных методов, клинические и терапевтические испытания инсулина, соматотропина, медиаторов иммунного ответа.   

 

1. Цитокины – большая гетерогенная группа белков с различными функциями, синтезируемая лимфоретикулярными клетками. Цитокины участвуют во многих видах взаимодействий, обеспечивающих функционирование иммунной системы и контроль гемопоэза. Первая группа цитокинов была представлена интерферонами (ИФН), часть цитокинов была классифицирована как интерлейкины (ИЛ), пронумерованные в порядке их обнаружения.

ИФН – это группа эндогенных гликопротеидов с м. м. около 3000, которые оказывают неспецифическое противовирусное действие, влияя на клеточные метаболические процессы синтеза РНК и белка. Первоначально было установлено, что ИФН вырабатывают клетки, инфицированные вирусами (тип 1), в дальнейшем – что ИФН вырабатывают также лимфоциты в ходе иммунной реакции (тип 2).

Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка.

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

- из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.

- полученным продуктом трансформируют Е. соli, образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.

-каждую группу клонов гибридизируют с ИФН-мРНК.

-из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и кРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка.

-определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН-мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН- кДНК человека.

 ИФН проявляют некоторые виды активности как лимфокины и иммуномодуляторы. ИФН 1 типа, действующие преимущественно как ингибиторы репликации вирусов в клетке, реализуют свой эффект, стимулируя выработку рибосомами клеток хозяина клеточных ферментов, которые тормозят продукцию вирусов, нарушая трансляцию вирусной мРНК и синтез вирусных белков.

 ИФН вырабатывают большинство видов животных, но проявление их активности видоспецифично, то есть они действуют только у того вида животных, в которых вырабатываются. Описаны три основных человеческих ИФН:

-ИФН -a, представляющий собой фибробластный ИФН типа 1;

ИФН -b - человеческий фибробластный ИФН типа 1;

ИФН -g - человеческий иммунный ИФН типа 2.

 ИФН, вырабатываемые клетками любого типа, различают по химическому строению и виду активности. ИФН является одним из основных эндогенных факторов, препятствующих поражению организма вирусной инфекцией (таблица 1).

 ИФН вызывают индукцию трех ферментов:

- протеинкиназы, нарушающей начальный этап построения пептидной цепи,

- олигоизоаденилат синтетазы, активирующей РНК-азу, которая разрушает вирусную РНК;

-фосфодиэстеразы, разрушающей конечные нуклеотиды иРНК, что приводит к нарушению элонгации пептида.

2. С учетом антивирусного и иммуномоделирующего эффектов ИФН в НПО «Биомед» предложены и успешно апробированы суппозитории с ИФН an1 и пробиотиками при терапии дисбактериозов вирусной и бактериальной этиологии, кандидозов; в гинекологической практике для лечения эндометритов, кольпитов, вагинитов и гинекологического герпеса.

Побочные эффекты ИФН включают лихорадку, утомляемость, головные боли, слабость, анемии, желудочно-кишечные и сердечно-сосудистые нарушения.

Развитие методов клонирования генов в значительной мере облегчило продукцию високоочищенных цитокинов всех типов и идентификацию большинства интерлейкинов (ИЛ).  Специфический ген человеческого ИЛ с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид (участок гибридной белковой молекулы, облегчающий идентификацию и очистку белка), переносят в микробные клетки-продуценты, где экспрессируется химерный белок (продукт клонированного гена, защищенный одной или несколькими аминокислотами от расщепления протеиназами клетки-хозяина). Конструирование рекомбинантных молекул ИЛ осуществляется набором специфических ферментов. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, очищают иммунноафинной хроматографией. Главным из цитокинов являются ИФНg и ИЛ-2. ИФНg - ключевой медиатор активации системы естественной цитотоксичности, регулирует процесс дифференцировки естественных киллерных клеток и их цитотоксическое взаимодействие с клетками-мишенями, стимулирует цитотоксические и регуляторные функции макрофагов, активирует цитотоксические лимфоциты. Под действием ИФНg повышается продукция цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ -12, ИФНb и фактора некроза опухолей a. ИЛ реализуют эффект через рецепторы на поверхности соответствующих клеток-мишеней. Многие ИЛ проходят стадию клинического излучения, другие нашли разнообразное применение в лечении инфекций, воспалительных, аутоимунных и неопластических расстройств. ИЛ-1 показан для лечения воспалений и септического шока. ИЛ -2 включен в схемы лечения имуногенных опухолей (меланомы, почечноклеточного рака, рака мочевого пузыря).


Таблица 1

Терапевтическое применение ИФН человека

Название препарата Подтип ИФН Способ получения Фармакологическое действие Показания к применению
Интерферон a Биосинтез в культуре лейкоцитов донорской крови под воздействием вирусов Антивирусное, иммуномодулирующее, антипролиферативное   Вирусные заболевания, лейкоз, злокачественная меланома, рак почек, карциноидный синдром
Интерлок a Биосинтез в культуре лейкоцитов донорской крови под воздействием парамиковирусов Подавляет жизнедеятельность ряда вирусов Вирусные заболевания глаз, гепатиты
Интерферон альфа-2 a2 Рекомбинантный Антивирусное, иммуномодулирующее, ингибирует пролиферацию большого спектра опухолевых клеток Эпителиальная форма острой и рецидивирующей вирусной инфекции глаз, онкологические заболевания
Интерферон альфа-2а a Рекомбинантный. Белок, содержащий 165 аминокислот Противовирусная, противоопухолевая активность Лейкемический ретикулоэндотелиоз, саркома капоши, рак почки, мочевого пузыря, меланома, опоясывающий лишай
Реаферон a2 Рекомбинантный ИФН, продуцируемый бактериальным штаммом псевдомонады, в генетический аппарат которой встроен ген человеческого лейкоцитарного ИФН a2. Идентичен человеческому лейкоцитарному ИФНa2.  Противовирусная, иммуномодулирующая, противоопухолевая активность Вирусные, опухолевые заболевания  
Интерферон альфа-n1 an1 Высокоочищенный человеческий интерферон Противовирусная Хронический активный инфекционный гепатит В
Интерферон бета b Суперпродукция фи-бробластов человека стимулятором в присутствии ингибиторов обменных процессов Противовирусная, иммуномодулирующая, противоопухолевая активность Хронические вирусные инфекции в офтальмологии, гинекологии и урологии, дерматологии, гепатологии, онкологии
Интерферон гамма l Рекомбинантный Противовирусная, иммуномодулирующая, противоопухолевая активность Хронические гранулематозные заболевания
Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...