 |
Пребиотики. Контрольные вопросы. Лекция 24. Биотехнология стероидных гормонов. План лекции
|
|
|
|
Пребиотики
Лактулоза (Lactulose)- синтетический дисахарид. Под влиянием препарата увеличивается количество лактобактерий, что приводит к повышению кислотности в просвете толстого кишечника; проявляется слабительный эффект без влияния на слизистую оболочку и гладкую мускулатуру кишечника. Лактулоза уменьшает образование и всасывание азотсодержащих токсичных веществ в проксимальном отделе толстого кишечника, не уменьшает абсорбцию витаминов, не вызывает привыкания. Форма выпуска – сироп, состоящий из лактулозы, галактозы, лактозы.
Пантотенат кальция. Утилизируется бифидобактериями и способствует увеличению их массы.
Памба (парааминобензойная кислота). Способствует росту бифидо- и лактобактерий, кишечных палочек.
Хилак форте – концентрат метаболизма бактерий. Способствует восстановлению нормофлоры.
Нормазе (лактулоза )- синтетический дисахарид. Понижает рН в толстом кишечнике, снижает концентрацию гнилостных бактерий, стимулирует перистальтику и рост бифидобактерий.
Лизоцим (Lysocim) – мукополисахаридаза, фермент белковой природы. Препарат оказывает бактериолитическое действие, разрушает полисахариды микробной клетки, подавляет рост грамположительных бактерий, стимулирует неспецифическую реактивность организма, оказывает противовоспалительное и муколитическое действие.
Контрольные вопросы
1. Положительные функции нормофлоры кишечника человека.
2. Причины, вызывающие дисбактериоз.
3. Пробиотики, пребиотики, симбиотики, особенности каждой группы.
4. Микроорганизмы, используемые для создания эубиотиков.
5. Препараты эубиотиков.
Лекция 24
|
|
|
Биотехнология стероидных гормонов
Форма проведения лекции: проблемная
План лекции
1. Традиционные источники получения стероидных гормонов.
2. Проблемы трансформации стероидных структур.
3. Преимущества биотрансформации перед химической трансформацией.
1. Несмотря на разнообразие биотрансформаций стероидов, методы проведения микробиологических реакций довольно единообразны. При поисковых работах, где не требуется или нет возможности применять большие количества вещества, ограничиваются проведением реакции в колбах на качалках, загрузка стероида в колбу составляет 100 - 200 мг. Для загрузок порядка 1-2 г стероида применяют стеклянные ферментеры. В промышленности и на опытных установках применяют стальные аппараты, оборудованные аэрирующими и перемешивающими устройствами.
Собранный стеклянный ферментер стерилизуют и загружают стерильной питательной средой с заранее внесенной в нее в асептических условиях трансформирующей культурой. Особое внимание уделяют наблюдению асептики во всех операциях. Стерилизацию в зависимости от объекта осуществляют автоклавированием питательной среды при 110 - 1200С в боксах, освещаемых бактерицидными лампами. Операции по загрузке, отбору проб проводят в пламени газовой горелки. Загрузка питательной среды в ферментер, как правило, осуществляется передавливанием стерильным сжатым воздухом. Время роста культуры микроорганизма-трансформатора определяется появлением максимальной трансформирующей активности и может колебаться от нескольких часов для одних культур до нескольких суток для других. Для многих культур-трансформаторов характерна максимальная трансформирующая активность в период снижения удельной скорости роста культуры.
Растворимость стерилов в воде очень низка. В настоящее время стерины, предназначенные для окисления, в небольшой концентрации (порядка 1 г/л) вносят растворенный в малотоксичном, смешивающемся с водой растворителе (ацетоне, спирте, диметилформамиде). При более высоких концентрациях стеринов (выше 1 г/л) их вносят в среду в виде мелкоизмельченной пудры; для этого кристаллы стерина растирают в специальной аппаратуре или разрушают ультразвуком.
|
|
|
Другой способ внесения стеринов для биотрансформации состоит в том, что стерин, например, рептостерин, растворяют в смеси гептан/этиленхлорид, добавляют при перемешивании воду и отгоняют растворитель нагреванием смеси до 950С. При таком методе концентрация ситостерина в водной суспензии может достигать 140 г/л.
Трансформация стеринов микроорганизмами основана на их использовании в качестве источника углерода, поэтому стимуляция роста трансформирующих штаммов должна приводить к увеличению выхода продуктов расщепления стеринов. Процесс стимулируется насыщением среды кислородом. Добавление в питательную среду некоторых масел в количестве 1-3 мас. % (соевого, арахисового, рапсового, оливкового) повышает выход продукта трансформации. Аналогичные результаты получены с применением глицеридов животного и растительного происхождения (тристеарин, триолеин, трипальмитин). Механизм стимуляции роста глицеридами, вероятно, состоит в устранении гидрофобности стеринов, глицериды действуют так же, как истинные ПАВ, обычно применяемых для микробиологических процессов трансформации. Температурный режим микробиологических трансформаций стероидов не отличается от принятых для других микробиологических процессов и составляет 24 - 330С. Условия рН определяются при отборе штамма культуры-трансформатора и колеблются в широком интервале.
2. Микробиологический контроль осуществляется только на стадии выращивания трансформирующей культуры. Аналитический контроль реакции трансформации ведется путем отбора проб через определенные временные интервалы и анализа их методом тонкослойной хроматографии на силуфоле в присутствии «свидетелей» исходного стероида, целевого продукта трансформации и некоторых промежуточиых и побочных продуктов, если они участвуют в данном процессе.
После завершения трансформации культуральная жидкость, отделенная от мицелия (или другой биомассы), экстрагируется несмешивающимся с водой органическим растворителем, пригодным для растворения соответствуюшего стероида (этилацетат, метиленхлорид или хлороформ). Экстракт, отделенный от водной фазы, проходит требуемую очистку (окрашенные примеси обычно отделяют обработкой с активировинным углем, затем уголь отфильтровывают). Далее его концентрируют в вакууме и полученный осадок стероида перекристаллизовывают из подходящего растворителя. В препаративных целях при работе с небольшими количествами стероидов очистку продукта трансформации можно проводить методом колоничной хроматографии.
|
|
|
3. Специфической особенностью процесса микробиологических трансформаций является использование чистых культур микроорганизмов-трансформаторов. Поэтому необходимым условием технологического режима является соблюдение мер для предотвращения развития посторонней микрофлоры. Последняя постоянно присутствует в воздушных потоках, циркулирующих в производственных помещениях, и представлена в основном мезофильными микроорганизмами, оптимальная температура развития которых находится в пределах 24 - 30 оС. Такой же температурный оптимум характерен, как правило, и для микроорганизмов-трансформаторов.
Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях с соблюдением правил и норм, разработанных и утвержденных для производста микробного синтеза. Однако внесение стероидного субстрата на трансформацию (в растущую на полноценной питательной среде культур при использовании бактерий или в водную суспензию неразмножающихся клеток в случае применения грибного мицелия) и сам процесс трансформации, как правило, проводят не стерильно. Для уменьшения вероятности загрязнения используют стерильную воду при приготовлении суспензии стероидных субстратов, поскольку сами стероиды обычно неустойчивы в условиях автоклавирования. Одним из вариантов решения этой проблемы может служить способ внесения стероидного субстрата в питательную среду и засева ее трансформирующей культурой в момент, когда температура среды после автоклавирования снизится до 80 оС и безопасна для субстрата. После выдержки в течение 30 мин. среду со стероидом охлаждают до 33 оС и в нее стерильно вносят трансформирующую культуру.
|
|
|
Используют культуру-трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а сильно разросшаяся культура подавляет рост других микроорганизмов. Однако и эти меры не полностью предохраняют трансформационную среду от загрязнения посторонней микрофлорой. В последней могут оказаться виды, способные отрицательно влиять на ход трансформации.
Применяемая в лабораторных условиях стерилизация суспензий стероидов ультразвуком неприемлема для промышленных масштабов.
|
|
|
