Контрольные вопросы. Лекция 19. Биотехнология антибиотиков

   Контрольные вопросы

    1. Биологическая роль витаминов.

2. Продуценты витаминов.

3. Биотехнологическое производство витаминов, особенности процессов.

4. Микробиологический синтез витамина В₂, В₁₂.

5. Микробиологический синтез эргостерина.

                  

Лекция 19

Биотехнология антибиотиков

    Форма проведения лекции: обзорная

    План лекции

 

    1. Создание антибиотиков новых поколений: поиски новых штаммов-продуцентов; химическая модификация уже имеющихся антибиотиков; мутасинтез.

   2. Классификация антибиотиков

  3. Производство антибиотиков

 

1. Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности различных групп микроорганизмов, низших и высших растений и животных или их модификаций, обладающие высокой физиологической активностью в отношении определенных групп микроорганизмов или злокачественных опухолей, избирательно задерживающие их рост или подавляющие развитие.

Образование антибиотиков – наследственно закрепленная особенность метаболизма организмов. Это проявляется в том, что каждый вид (или даже штамм) способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. Вместе с тем одинаковые антибиотики могут образовываться несколькими видами организмов (это свидетельство того, что данные микроорганизмы имеют общего предка). Образование антибиотика обусловлено определенным характером обмена веществ, возникающим и закрепленным в процессе эволюции организма. Эволюционное значение антибиотиков подчеркивается тем, что в антибиотикообразование может быть включено около 1% генов продуцента (род Streptomyces) и эта часть ДНК, несмотря на энергетические затраты при ее репликации, не теряется во время селекции в естественных условиях.

Образование антибиотиков – фактор биологический, имеющий адаптационное значение. Для продуцента способность образовывать антибиотики важна не постоянно, а лишь в неблагоприятных условиях, например, при истощении среды питательными компонентами, при контакте со специфическими продуктами жизнедеятельности другого организма.

Формы взаимодействия между организмами весьма разнообразны – от мирного сожительства до явного антагонизма. Типы связей внутри микробиологических сообществ подразделяют на трофические и метаболические. Трофические связи характерны для метабиоза (последовательное использование субстрата), когда продукты жизнедеятельности одного микроорганизма, содержащие значительное количество энергии, потребляют другие виды микроорганизмов в качестве питательного материала. Метаболические связи выстраиваются, когда одни микроорганизмы могут потреблять отдельные продукты метаболизма других микроорганизмов или продукты метаболизма являются их ингибиторами.

Тип связи определяет специфику взаимодействия организмов. Симбиотические взаимоотношения характеризуются тем, что различные виды микроорганизмов создают для себя взаимовыгодные условия. Например, совместное развитие аэробных и анаэробных микроорганизмов: развиваясь в аэробных условиях, микробы поглощают кислород, создавая благоприятные условия для развития анаэробов. Паразитизм – форма взаимоотношений, при которой некоторые микробы развиваются за счет веществ клетки других организмов, например бактерии. Паразиты бывают внеклеточные (риккетсии) и внутриклеточные (вирусы). Хищничество имеет место, когда некоторые микробы поглощают клетки организмов других видов, используя их в качестве источника питания (преимущественно продукты лизиса живых клеток других бактерий). К числу микроорганизмов-хищников относятся, главным образом, миксоформы (миксобактерии, миксоамебы, миксомицеты). Антагонизм – это условия, при которых один вид микроорганизмов угнетает или полностью подавляет рост и развитие других видов. Явление антагонизма широко распространено среди бактерий, актиномицетов, грибов и других микроорганизмов. Образование антибиотических веществ – специфическая особенность вида или даже штамма микроорганизмов, возникшая в результате их эволюционного развития как одна из приспособительных особенностей.

В естественных условиях четко ограниченных форм взаимоотношений не наблюдается. В процессе эволюции на разных этапах роста организмов и в зависимости от условий их развития один тип взаимодействия может смeниться другим. Так, ряд бактерий (E. coli, B. subtilis, B. cereus и др. ) образуют фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин, выделяемый Penicillium notatum, P. chrisogenum и мицелиальными грибами других видов.

Антибиотики – первые лекарственные средства, полученные биотехнологическим способом. С антибиотиками человечество сталкивается с древних времен. У же в Библии упоминается использование травы иссоп для лечения кожных заболеваний. Эта трава, как известно, поражается плесенью рода Penicillium или Aspergillus и может быть насыщена метаболитами грибов антибиотического характера.

Основные этапы развития производства антибиотиков

1870 г. - обнаружено, что в среде, содержащей плесень, бактерии не развиваются (Д. Сандерсон);

1872 г. - доказана способность Penicillium glaucum подавлять рост бактерий (Д. Листер);

1871-1872 гг. - показано, что молодая культура зеленой плесени - грибы рода Penicillium - способна задерживать развитие возбудителей ряда кожных заболеваний человека (В. А. Манассеин, А. Г. Полотебнов);

1877 г. - опубликовано сообщение о подавлении роста Bacillus anthracis аэробными бактериями (Л. Пастер и С. Джеберт, А. Г. Лебедин­ский);

1929 г. - обнаружены антибиотические свойства грибов Penicillium (А. Флеминг);

1940 г. - выделена субстанция пенициллина (X. Флори, Е. Чейн);

1942-1956 гг. - коллектив ученых и практиков во главе с академи­ками Л. А. Зильбером и З. В. Ермольевой провели поиск и отбор штам­мов-продуцентов; разработали ферментационные среды и первые рег­ламенты промышленного производства бензилпенициллина. Сравнение двух штаммов (советского и английского) показало, что советский штамм образует                28 ед/мл, английский — 20 ед/мл.

Открытие и изучение свойств нового антибиотика, применяемого в медицинской или сельскохозяйственной практике, — это огромный труд ученых различных направлений (микробиологов, биохимиков, миколо­гов, химиков, генетиков, фармакологов, биотехнологов, врачей).

Со времени открытия пенициллина из разных микроорганизмов были вы­делены более 6000 антибиотиков, обладающих разной специфичностью и разным механизмом действия. Их широкое применение для лечения инфекционных заболеваний помогло сохранить миллионы жизней.

Основные причины быстрого роста числа антибиотиков:

-многие антибиотические вещества или продукты их модифика­ции являются незаменимыми ЛП при инфекционных заболева­ниях, ранее считавшихся неизлечимыми;

- изменилась этиологическая структура инфекционных заболева­ний, возросло число видов бактерий, их индуцирующих; широ­кое распространение получили инфекции, вызываемые грамотрицательными инфекциями, оттеснив стафилококковые заболе­вания;

- как лечебные средства антибиотики применяют в животновод­стве, птицеводстве, пчеловодстве, растениеводстве; отдельные антибиотики являются стимуляторами роста животных;

- проблема резистентности микроорганизмов предполагает заме­ну одних антибиотиков другими, более эффективными;

- некоторые антибиотики применяют в качестве консервантов в пищевой промышленности;

- развитие химии природных соединений (изучение структуры, их модификация и синтез) способствует появлению новых зна­ний об антибиотиках;

- антибиотики используют при изучении отдельных сторон мета­болизма организмов, расшифровке тонких молекулярных меха­низмов биосинтеза белка, механизма функционировании мем­бран, специфических ингибиторов ферментов, в первую оче­редь, инактивирующие антибиотики.

Подавляющее большинство основных антибиотиков было выделено из грамотрицательной почвенной бактерии Streptomyces, хотя их про­дуцируют также грибы и другие грамположительные и грамотрицательные бактерии. Ежегодно во всем мире производится 100000 т антибиотиков на сумму около 5 млрд долларов, в том числе более 10 млн долларов приходится на долю антибиотиков, добавляемых в корм скоту в качестве пищевых добавок или ускорителей роста.

По оценкам ВОЗ каждый год ученые обнаруживают от 100 до 200 новых антибиотиков, прежде всего в рамках обширных исследователь­ских программ по поиску среди тысяч различных микроорганизмов та­ких, которые синтезировали бы уникальные антибиотики.

Получение, лабораторные и клинические испытания новых лекарственных средств обходятся дорого, до применения доходят только те из них, которые имеют большую терапевтическую ценность и представляют экономиче­ский интерес; на их долю приходится 1- 2 % всех обнаруживаемых ан­тибиотиков.

Образование антибиотиков — наследственно закреплённая особен­ность метаболизма микроорганизмов, проявляющаяся в том, что каж­дый вид (или даже штамм) способен продуцировать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ, что обусловлено определённым характером обмена, возникающим и закреплённым в процессе эволюции микроорганизма.

Метаболиты яв­ляются промежуточными продуктами обмена веществ, результатом катаболических и анаболических реакций; конечный продукт обмена - антибиотики - синтезируются из первичных метаболитов.

Специфичность антибиотиков характеризуется:

 - высокой биологической активностью в отношении чувствитель­ных к ним организмов, т. е. способностью проявлять эффект да­же в очень низких концентрациях;

- избирательностью действия, т. е. способностью конкретного ан­тибиотика проявлять свое действие лишь в отношении опреде­ленных организмов или групп организмов, не оказывая заметно­го эффекта на другие формы живых существ.

Величину биологической активности антибиотиков выражают в ус­ловных единицах, содержащихся в 1 мл (ед/мл) или в 1 мг (ед/мг) пре­парата. За единицу антибиотической активности принято минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост определенного числа клеток стандартного штамма тест-микроба в единице объема питательной среды. Так, за единицу активности пени­циллина приято минимальное количество препарата, способное задер­живать рост золотистого стафилококка (штамм 209) в 50 мл питатель­ного бульона; для стрептомицина единица активности - минимальное количество антибиотика, задерживающее рост Е. coli в 1 мл питатель­ного бульона.

Угнетение роста микроорганизмов антибиотиками может осуществ­ляться только при наличии трех условий:

- биологически важная для жизнедеятельности бактерий система должна реагировать на воздействие низких концентрацией пре­парата через определенную точку приложения;

- препараты должны обладать способностью проникать в бакте­риальную клетку и воздействовать на точку приложения;

- препарат не должен инактивироваться раньше, чем вступит во взаимодействие с биологически активной системой бактерии.

Точки приложения действия антибактериальных препаратов в бак­териях различны - большая часть их находится в клеточной мембране и внутри клетки. Для достижения этих точек антибиотики сначала долж­ны проникнуть через поверхностные слои клетки, находящиеся снару­жи от цитоплазматической мембраны.

Главным барьером на этом пути препарата является клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится большое количество мукопептидов, яв­ляющихся основной мишенью для антибиотиков.  

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий содержит большое количество липидов, в силу чего она менее проницаема и является надежным барьером для многих антибактериальных средств. Это обстоятельство служит причи­ной поиска новых антибиотиков (полусинтетические пенициллины и цефалоспорины), которые обладают хорошей проникающей способно­стью через липополисахаридный слой грамотрицательных бактерий и имеют высокую активность против большинства из них.

2. Сложилось несколько подходов к классификации антибиотиков:

- по принципу биологического происхождения (предпочтительна для биологов, изучающих организмы-продуценты антибиотиче­ских веществ);

- по химическому строению (удобна для химиков, занимающихся изучением строения молекул антибиотиков и путей из синтеза);

- по типу и механизму биологического действия (принята в меди­цинской практике).

Тип действия антибиотиков бывает цидным (бактерицидным, фун-гицидным, вирицидным, протозоацидным), под ним понимают необра­тимое нарушение жизнедеятельности (гибель) инфекционного агента, и статическим (бактериостатическим, фунгистатическим, виристатиче-ским, протозоостатическим), при котором прекращается или приоста­навливается размножение возбудителя.

Такая градация имеет основное практическое значение при лечении тяжелых инфекций, особенно у па­циентов с нарушениями иммунитета, когда обязательно назначение «цидных» препаратов.

Связь антимикробного препарата с точками приложения в микроб­ной клетке может быть прочной или непрочной, что, в той или иной мере, определяет степень активности данного препарата.

Антибиотики должны обладать высокой избирательной токсичностью, т. е. они долж­ны быть активны по отношению к микробным клеткам и безвредны для клеток больного организма.

Подобная избирательная токсичность мо­жет быть реализована лишь в том случае, если активные биохимические системы микробных клеток — мишени антибиотиков — отличны от по­добных систем клеток макроорганизма.

Селективная токсичность мо­жет носить пограничный характер, когда отличия в биохимических структурах клеток организма человека и бактерии заключаются в раз­личном положении фосфолипидов в цитоплазматической мембране.

Проблема селективности антибиотиков сложнее по причине того, что для репликации вирусы используют ферменты клеток хозяина.

В зависимости от точки приложения и механизма биологического действия антибиотики делят на:

I. Специфические ингибиторы биосинтеза клеточной стенки (пе-нициллины, цефалоспорины и цефамицины, ванкомицин, ристомицин, циклосерин, бацитрацин, тиенамицины и др. )

II. Препараты, нарушающие молекулярную организацию и функ­ции клеточных мембран (полимиксины, полиены).

III. Препараты, подавляющие синтез белка на уровне рибосом (макролиды, линкомицины, аминогликозиды, тетрациклины, левомицетин, фузидин).

IV. Ингибиторы синтеза РНК на уровне РНК-полимеразы и инги­биторы, действующие на метаболизм фолиевой кислоты (рифампицины).

V. Ингибиторы синтеза РНК на уровне ДНК-матрицы (актиномицины, антибиотики группы ауреоловой кислоты).

VI. Ингибиторы синтеза ДНК на уровне ДНК-матрицы (митомицин С, антрациклины, нитрофураны, налидиксовая кислота).

При выделенном возбудителе назначают антибиотики с максималь­но узким спектром активности, так как «избыточная» широта спектра не дает преимуществ и опасна с точки зрения подавления нормальной микрофлоры.

Общая стратегия рекомбинантных микроорганизмов, способных синтезировать антибиотики, состоит во введении в организм хозяина специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойст­венные микроорганизму метаболические реакции, или генов, влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений.

При создании рекомбинантных штаммов Streptomyces - основного микроорганизма, используемого для получения антибиотиков, важно, чтобы трансформация и отбор трансформированных клеток не должны быть слишком сложны. В отличие от Е. coli, Streptomyces существуют не в виде изолированных клеток, а в виде протяженных мицелл, поэто­му перед трансформацией необходимо ферментативное разрушение клеточной стенки мицелл и высвобождение отдельных протопластов.

Без этого невозможно отличить трансформированные клетки от нетрансформированных, поскольку видимые колонии на твердой среде будут образовываться из группы клеток, а не из индивидуальной клет­ки. Соответственно колонии, растущие в присутствии селективного ан­тибиотика, будут представлять собой смесь трансформированных и нетрансформированных клеток.

Проникновение плазмидной ДНК в про­топласты Streptomyces облегчается в присутствии ПЭГ. После транс­формации протопласты высевают на твердую среду, чтобы образова­лась клеточная стенка, а затем для отбора трансформированных клеток переносят на селективную среду, обычно содержащую неомицин, где образуется колония, выросшая из трансформированных клеток, способ­ных синтезировать антибиотик.

С помощью генетических или биохимических экспериментов мож­но идентифицировать, затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза антибиотиков, определить их N-концевые ами­нокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезиро­вать олигонуклеотидные комплементарные последовательности.

3. Технологический процесс производства антибиотиков представлен на рисунке 5.

Биосинтез антибиотика осуществляется микроорганизмами на опре­делённом этапе их развития. Эта закономерность характерна для бакте­рий, мицелиальных грибов (Penicillium chrysogenum, Aspergillus fumigatus и др. ) и для большинства актиномицетов, образующих такие анти­биотики, как стрептомицин, хлортетрациклин, окситетрациклин и дру­гие.

Максимально высокую активность штамма-продуцента способна обеспечить технология рекомбинантных ДНК, так как можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Генно-инженерные подходы используются для увеличения выхода антибиотиков и соответственно снижения стоимости их производства.

Примеры промышленных продуцентов основных антибиотиков, ис­пользуемые в РФ, представлены в таблице 2.

При проведении первой стадии технологического процесса (рис. 7) применяют натуральные среды неопределенного состава, к числу кото­рых относят продукты крахмалопаточного производства, агар, желатин, отруби, зерно. Композиция натуральных сред неопределенного состава не является постоянной. Например, агар, получаемый из разных видов морских водорослей, по химическому составу — сложный эфирный комплекс полисахарида с серной кислотой и разнообразными микроэле­ментами. Агар содержит также жирные кислоты, биотин, тиамин или его компоненты.  В картофельной среде с глюкозой и пептоном, при одной и той же партии пептона и химически чистой глюкозы, состав карто­фельного экстракта зависит от сорта картофеля, места его произраста­ния, времени уборки, срока и режима хранения и других причин. По­этому для получения сопоставимых результатов, особенно при изуче­нии физиологических и биохимических особенностей микроорганизма, применяют синтетические среды, в состав которых входят определен­ные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концен­трациях.

Задача второй стадии - создать оптимальные условия для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза необходимого анти­биотика. Особенность производства антибиотиков - двухфазный ха­рактер развития продуцентов.

В первой фазе развития культуры, но­сящей название тропофазы (фазы сбалансированного роста микроорга­низма), идет интенсивное накопление биомассы продуцента. Продуцент синтезирует белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, ферменты, и дру­гие БАВ, необходимые для роста микроорганизма; наблюдается бы­строе потребление основных компонентов субстрата, интенсивное по­глощение кислорода. В культуральной среде может снижаться рН, как результат накопления органических кислот. В тропофазе антибиотик, как правило, не образуется или его количество незначительное. Воз­можно, в этой фазе синтез ферментов, принимающих участие в образо­вании антибиотика, подавлен.

Во второй фазе — идиофазе (фазе несба­лансированного роста микроорганизма) - накопление биомассы замед­лено. Культуральная среда уже обеднена компонентами, необходимыми для развития продуцента и обогащена продуктами его жизнедеятельно­сти. В культуре преобладают протеолитические процессы, приводящие к её подщелачиванию. Продукты метаболизма микроорганизма частич­но используются на построение клеток мицелия, частично - на синтез антибиотика. Максимум биосинтеза антибиотика в культуральной среде наступает, как правило, после максимального накопления биомассы, этот максимум неодинаков у разных микроорганизмов и при разных условиях культивирования. Практика промышленной микробиологии показывает, что процесс получения того или иного продукта жизнедеятельности активнее идет в смешанных культурах, при совместном развитии нескольких видов (чаще двух) микроорганизмов.

Совместным культивированием специ­ально подобранных микроорганизмов создают условия, при которых значительно увеличивается образование антибиотиков, как результат активации ряда биохимических процессов. В смешанных культурах ферментативная реакция служит ответом на проявление определенных антагонистических взаимоотношений. При совместном культивирова­нии различных микробов могут возникать своеобразные гибриды этих организмов, обладающие иными свойствами по сравнению с исходны­ми чистыми культурами. С накоплением определенной концентрации антибиотика рост мик­роорганизмов прекращается (например, Streptomyces griseus прекращает свой рост при концентрации в среде стрептомицина сульфата 0, 5%). Из культуральной среды антибиотики выделяют экстракцией органиче­скими растворителями, осаждением, адсорбцией. Очистку антибиотиков проводят повторной заменой растворителя, адсорбционно-хроматографическими методами, ВЭЖХ.

         Рисунок 7. Схема производства антибиотиков в процессе микробного

                биосинтеза (по Н. Е. Егорову)

Таблица 2. Промышленные продуценты антибиотиков

Антибиотик	Продуцент
Антибиотики, образуемые бактериями
1. Грамицидин С	Bacillus brevis
2. Полимиксины	Bacillus polymyxa
3. Бацитрацины	Bacillus licheniformis и В. erevis
4. Низин	Streptococcus lactis
Антибиотики, образуемые актиномицетами
1. Стрептомицин	Streptomyces griseus
2. Неомицин	Streptomyces fradiae
3. Канамицин	Streptomyces kanamyceticus
4. Гентамицин	Micromonospora purpurea
5. Сизомицин	Micromonospora inyoensis
6. Тобрамицин	Streptomyces tenebraris
7.  Хлортетрациклин	Streptomyces aureofaciens
8. Окситетрациклин	Streptomyces rimosus
9. Амфотерецин В	Streptomyces noolosus
10. Тетерациклин	Streptomyces aureofaciens
11. Хлорамфеникол	Streptomyces venezuelae
12. Эритромицин	Saccharopolyspora erythraea
13. Спирамицин	Streptomyces ambofaciens
14. Тилозин	Streptomyces fradiae
15. Нистатин	Streptomyces noursei
16. Леворин	Streptomyces levoris
Антибиотики, образуемые грибами
1. Пенициллины	Penicillium chrysogenum
2. Цефалоспорин	Cepholosporium acremonium
3. Циклоспорин	Trichoderma polysporum
4. Гризеофулызин	Penicillium griseofulvum
5. Фузидин	Fusidium coccineum

⇐ Предыдущая14151617181920212223Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: