 |
Контрольные вопросы. Лекция 25. Биотрансформация стероидных гормонов. План лекции
|
|
|
|
Контрольные вопросы
1. Какие химические модификации стероидной молекулы осуществляются с помощью биотрансформации?
2. Биотрансформация, особенности процесса.
Лекция 25
Биотрансформация стероидных гормонов
Форма проведения лекции: проблемная
План лекции
1. Штаммы микроорганизмов, обладающие способностью к трансформации (биоконверсии) стероидов.
2. Конкретные реакции биоконверсии стероидов. Подходы к решению селективности процессов биоконверсии.
3. Микробиологический синтез гидрокортизона, получение из него путем биоконверсии преднизолона.
1. Специфической особенностью процесса микробиологических трансформаций является использование чистых культур микроорганизмов-трансформаторов. Поэтому необходимым условием технологического режима является соблюдение мер для предотвращения развития посторонней микрофлоры. Последняя постоянно присутствует в воздушных потоках, циркулирующих в производственных помещениях, и представлена в основном мезофильными микроорганизмами, оптимальная температура развития которых находится в пределах 24 - 30 оС. Такой же температурный оптимум характерен, как правило, и для микроорганизмов-трансформаторов.
Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях с соблюдением правил и норм, разработанных и утвержденных для производста микробного синтеза.
2. Примеры промышленного ислользования микробиологических трансформаций. Получение гидрокортизона (кортизола) из вещества S осуществляется с помощью С. lіnаtа.
Процесс включает следующие стадии:
1. Выращивание трансформирующей культуры (I стадия) производят путем трех последовательных генераций на питательной среде, содержащей сахарозу, дрожжевой автолизат и сложный набор неорганических солей:
|
|
|
лабораторный инокулят 1 – генерации, инокулят 2-й, инокулят 3-й генерации.
Крышку инокулятора перед засевом обрабатывают водным раствором формалина, аппарат и все помещение облучают бактерицидной лампой и весь процесс выращивания трансформирующей культуры проводят в стерильных условиях. Далее полученная трансформирующая культура поступает в сепаратор, откуда отделенный мицелий в виде водной суспензии передается в ферментер для проведения основной реакции трансформации вещества S.
2. Трансформация вещества (II стадия) также начинается со стерилизации ферментера и воздушного фильтра водным раствором формалина. Особое внимание уделяется размолу стероида на микромельнице и получению суспензии его в стерильной воде с содержанием стероида 1 г/л. Для предотвращения развития посторонней микрофлоры используется добавка антибиотика. Перемешивание и аэрация осуществляются, как и на предыдущей стадии, так же используются и пеногасители.
3. Выделение продукта трансформации - гидрокортизона (ІІІ стадия). Культуральная жидкость вместе с мицелием после ІІ-й стадии поступает на сепарацию. Отделенный мицелий промывается, промывные воды присоединяются к основной культуральной жидкости. Далее производится экстракция-сепарация продукта трансформации из водной среды органическим растворителем. Осветленный активированным углем экстракт подвергается многократному упариванию с различными растворителями, осветлению, снова упариванию досуха и промывке подходящим растворителем. Последние приемы обработки готового технического продукта обычны для технологии получения многих органических веществ и лекарственных препаратов. Получение чистых лекарственных форм гидрокортизона проводится традиционными методами.
|
|
|
Трансформация гидрокортизона в преднизолон:
Выращивание трансформирующей культуры М. globiformeосуществляется такими же последовательными этапами и в тех же аппаратах при тех же условиях аэрации и перемешивания, далее проводится трансформация гидрокортизона с помощью названной дегидрирующей культуры. Выделение готового продукта, преднизолона, осуществляется также путем экстракции-сепарации из культуральной жидкости, отличаясь лишь набором растворителей.
В настоящее время интенсивно разрабатываются методы использования мелкокристаллических стероидных субстратов. Микронизация субстрата до размеров частиц в несколько микрометров и внесение в ферментационную среду без растворителя позволяет повысить исходную концентрацию стероидного субстрата до 20 - 50 г/л.
Описан процесс, получивший название псевдокристаллферментации: дегидрирование измельченного порошка кортизона с помощью культуры Аgrоbасtеr sіtlіехв течение 5 дней. Получен кристаллический преднизолон с выходом 93%. Загрузку стероидного субстрата удается при этом довести до 500 г/л. Дегидрирование микрокристаллического гидрокортизона происходит по схеме:
гидрокортизон (кристаллы) - гидрокортизон (раствор) - преднизолон (раствор) -преднизолон (кристаллы)
В ходе реакции кристаллический гидрокортизон переходит в растворенное состояние и трансформируется внутри клеток в преднизолон, который, накапливаясь, кристаллизуется в виде игл. Отмечено также постоянное остаточное количество гидрокортизона при проведении «псевдокристаллферментации». Предполагают образование при этом «смешанных» кристаллов, состоящих из молекул гидрокортизона и преднизолона, соединенных в определенном соотношении (8: 92) в осадок. Однако этот процесс до настоящого времени не получил широкого практического применения.
Одним из путей интенсификации процессов трансформации является предварительное индуцирование растущей культуры - трансформатора соответствующим субстратом или его аналогом. Этот прием связан с индуцированием биосинтеза соответствующих ферментных систем культуры и особенно широко применяется в процессах микробиологической дегидрогенизации.
|
|
|
Наиболее перспективным считается применение закрепленных (иммобилизованных) живых клеток микроорганизмов. Преимущества использования иммобилизованных клеток в технологии очевидно:
1. отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;
2. более высокая активность и стабильность по сравнению с иммобилизованными ферментами и свободными клетками;
3. уменьшение затрат на выделение и очистку продуктов реакции, ввил\ду их изолированности от биомассы и некоторых продуктов обмена;
4. появление возможности создания непрерывных автоматизированных процессов;
5. способность к длительному функционированию полиферментных систем и регенерации кофакторов.
Методы иммобилизации клеток:
1. адсорбция;
2. ковалентное и поперечное связывание;
3. метод включения в различные полимеры;
4. микрокапсулирование.
Метод включения, в частности, в целлюлозные волокна мембраны весьма технологичен и является перспективным для проведения одностадийных процессов. Одним из наиболее экономичных носителей для иммобилизации клеток является капля-каррагинан, полисахарид изприменяемых как пищевая добавкаморских красных водорослей Rоdорусеае, Gіnаtrіnасeаe. Интектные клетки, введенные в гель, интенсивно размножаются на питательной среде и могуг многократно использоваться как полиферментные системы.
Включение в альгинатные гели относится к мягким методам иммобилизации, т. е. клетки после иммобилизации остаются жизнеспособными и могут осуществлять полиферментные процессы. Положительными качествами геля являются возможность размножения в нем клеток, а также его способность к растворению при изменении рН и температуры, что позволяет выделять жизнеспособные клетки и облегчает изучение их физиологии и морфологии. Во многих случаях включение клеток в альминат приводит к лучшим результатам по сравнению с карратизаном. Преимущества иммобилизованных клеток делают их весьма перспективными. В частности, трансформации стероидных соединений. Именно стероиды были одними из первых субстратов, которые удалось трансформировать с помощью иммобилизованных клеток. В настоящее время достаточно досконально изучены процессы трансформации стероидных соединений живыми иммобилизованными клетками, исследованы пути направленного изменения ферментативной активности и ее стабилизации.
|
|
|
