Методы препаративной химии и биохимии

Особенности биологических макромолекул как объектов исследования: высокая молекулярная масса, денатурация, полиэлектролитная природа, низкая скорость диффузии.

Оборудование биохимической лаборатории, специальные материалы и реактивы. Отделение осадков и нерастворимых веществ. Центрифугирование. Ультрафильтрация. Некоторые приемы, используемые при работе с белковыми растворами. Диализ.

Разделение белков путем осаждения. Общие положения. Растворимость белков при низкой концентрации солей. Высаливание при высокой концентрации соли. Осаждение белков органическими растворителями. Осаждение белков органическими полимерами и другими веществами. Осаждение вследствие избирательной денатурации. Осаждение нуклеиновых кислот. Кристаллизация белков.

 

Методы выделения органелл

Приготовление экстракта. Исходный материал. Особенности различных видов живых организмов в качестве исходного материала биохимических исследований. Свежесть сырья и его хранение.

Разрушение клеток и экстракция. Способы разрушения клеток. Растворы, используемые для экстракции. Буферные растворы и специальные добавки. Оптимизация и осветление экстракта. Особенности приготовления экстрактов растительных тканей и микроорганизмов.

Методы, используемые при очистке белков, ассоциированных с частицами. Детергенты и их применение.

 

Методы дифференциального центрифугирования

Центрифуга, ее устройство. Силы, действующие на частицу в роторе центрифуги. Скорость осаждения частиц. Константа седиментации. Раздельное осаждение частиц. Дифференциальное центрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности. Методы получения ступенчатых и непрерывных градиентов плотности.

 

Хроматография

5.1. Классификация и элементы теории хроматографии

Классификация хроматографических методов. Классификация по принципу фракционирования. Классификация по способу элюции. Классификация по расположению неподвижной фазы.

Элементы теории хроматографической элюции. Хроматографический процесс. Хроматографическая зона. Концепция теоретических тарелок. Кинетическая теория хроматографии. Разрешение близко мигрирующих зон. Оптимизация условий фракционирования. Градиентная элюция. Хроматография макромолекул.

5.2. Материалы матриц сорбентов и обменников

Целлюлоза. Гели на основе декстрана (сефадексы). Агароза. Полиакриламидный гель. Сефакрилы. Ультрогели. Полистирольные смолы. Полиамидные смолы. Кизельгур (целит, диатомовая земля). Силикагель. Окись алюминия. Пористое стекло. Оксиапатит.

5.3. Техника колоночной хроматографии

Хроматография при низком давлении. Хроматографические колонки. Резервуары для элюента. Смесители. Внесение препарата в колонку. Перистальтические насосы. Детекторы. Коллекторы фракций. Вспомогательное оборудование.

Хроматография при высоком давлении. Колонки. Внесение препарата. Задание градиента элюции. Детекторы.

Хроматография при умеренном давлении.

5.4. Гель-фильтрация

Общая характеристика метода. Принцип метода. Коэффициенты распределения. График селективности. Эффективность фракционирования.

Характеристика продажных матриц.

Методические особенности гель-фильтрации при низком давлении. Подготовка матрицы. Набивка колонки. Проверка качества набивки. Определение V ₀. Внесение препарата. Поддержание рабочего режима. Регенерация колонки.

Выбор параметров хроматографического процесса. Выбор матрицы. Размеры колонки. Выбор элюента. Скорость элюции. Оптимизация условий эксперимента.

Области применения. Очистка и фракционирование макромолекул. Определение молекулярной массы белка. Обессоливание и смена буфера.

Гель-фильтрация при высоком давлении. Гель-фильтрация в тонком слое.

5.5. Распределительная хроматография

Принцип метода. Нормальнофазовая распределительная хроматография. Распределительная хроматография в обращенных фазах.

Обратнофазовая гидрофобная хроматография при низком давлении. Немодифицированная сефароза. Элюция снижающимся градиентом концентрации соли. Гидрофобизированные гели агарозы.

Распределительная хроматография при высоком давлении.

5.6. Адсорбционная хроматография

Принцип метода. Сорбенты. Приготовление оксиапатита. Сорбционные свойства оксиапатита. Сорбция белков. Сорбция нуклеиновых кислот. Некоторые особенности хроматографии на оксиапатите. Фракционирование и очистка белков. Фракционирование и очистка нуклеиновых кислот. Разделение двунитевой и однонитевой ДНК. Очистка гибридов ДНК-РНК.

5.7 Ионообменная хроматография

Принцип метода. Компоненты хроматографической системы. Ионообменники. Элюент. Хроматографируемые вещества. Хроматографический процесс. Ионные взаимодействия вещества и сорбента. Управление силой ионного взаимодействия. Неионные взаимодействия вещества и сорбента.

Характеристики продажных ионообменников.

Подготовка обменников к набивке в колонку. Преформирование и промывка. Перевод в нужную ионную форму. Опасность поглощения СО₂.

Применение статической ионообменной хроматографии. Нейтрализация щелочи или кислоты без образования соли. Замена ионов. Обессоливание растворов. Удаление некоторых органических примесей. Концентрирование препаратов. Разделение компонентов смеси, сильно различающихся сродству к обменнику.

Выборусловий динамической ионообменной хроматографии. Выбор ионообменника. Выбор типа элюции. Выбор рН буфера для элюции. Выбор концентрации соли. Сохранение нативности препарата. Выбор объема элюента. Выбор размеров колонки. Выбор скорости элюции. Сбор и обработка фракций. Регенерация ионообменника.

Применение динамической ионообменной хроматографии.

Ионообменная ЖХВД белков.

Хроматофокусирование. Принцип метода. Колонки для хроматофокусирования. Фракционирование белков.

5.8. Аффинная хроматография

Принцип метода. Компоненты аффинного сорбента. Матрицы. Активация матриц. Спейсеры. Активированные спенсеры. Лиганды с индивидуальной специфичностью. Лиганды с групповой специфичностью. Посадка лигандов на активированные матрицы. Посадка лигандов на спейсеры с помощью конденсирующих агентов. Характер закрепления лиганда на матрице. Иммобилизация нуклеиновых кислот в качестве лигандов. Сорбенты для ковалентной хроматографии.

Выбор условий хроматографии. Выбор сорбента и характера хроматографического процесса. Выбор концентрации лиганда. Загрузка сорбента. Выбор буфера для посадки вещества. Выбор элюента и метода элюции. Биоспецифическая элюция. Проведение эксперимента. Электрофоретическая элюция. Аффинная элюция с ионообменника.

Применение аффинной хроматографии.

Аффинная ЖХВД. Аффинный электрофорез

5.9. Тонкослойная хроматография

Особенности метода. Техника ТСХ. Приготовление пластинок. Нанесение препаратов. «Проявление» пластинок (хроматографическая элюция). Обнаружение пятен или полос. Элюция вещества с пластинки.

Применение ТСХ.

 

Электрофорез

6.1. Теоретические и методические основы электрофореза

Принципы электрофореза. Электрофорез с подвижной границей. Зональный электрофорез без поддерживающей среды. Непрерывный электрофорез в тонком слое жидкости (про­точный электрофорез в свободной среде). Зональный электрофорез в градиенте плотности.

Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капилляр­ной структурой. Электрофорез на фильтровальной бумаге. Электрофорез на ацетате целлюлозы.

Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддержи­вающей среды.

Электрофорез в агаровом и агарозном гелях. Теория электрофореза в агаровом (агарозном) геле. Аналитический электрофорез в агаровом (агарозном) геле. Препаративный электрофорез в агаровом и агарозном гелях.

Электрофорез в крахмальных гелях.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Теория электрофореза в полиакриламидном геле. Физико-химические свойства составных частей геля. Аналитический электрофорез в полиакриламидных гелях. Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле

6.2. Изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез

Изоэлектрическое фокусирование. Принцип метода. Формирование градиентов рН. Методические приемы изоэлектрического фокусирования. Трудности, связанные с разделением белков методом ИЭФ. Аналитическое и препаративное изоэлектрическое фокусирование

Изотахофорез

6.3. Обнаружение, количественное определение и характеристика
макромолекул после электрофореза

Выявление макромолекул по поглощению ультрафиолетового света и флуоресценции. Выявление разделенных при электрофорезе компонентов путем их окрашивания. Сканирование окрашенных электрофореграмм. Фотографирование электрофореграмм. Высушивание полиакриламидных гелей. Разрезание полиакриламидных гелей. Выявление радиоактивности после электрофореза.

6.4. Электрофорез белков

Поведение белков при электрофорезе. Разделение белков в соответствии с размерами молекул: опреде­ление их молекулярной массы. Двухмерный электрофорез.

Окрашивание белков на электрофореграммах. Обнаружение белков по их ферментативной активности.

6.5. Электрофорез нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов

Электрофоретические методы разделения нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. Электрофорез нуклеиновых кислот в агаровом и агарозном гелях. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидных гелях. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидно-агарозных гелях. Особые проблемы, возникающие при электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот. Изоэлектрофокусирование нуклеиновых кислот. Обнаружение нуклеиновых кислот после электрофореза. Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот в геле. Микрометоды электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Определение молекулярной массы полинуклеотидов. Электрофорез нуклеопротеидных частиц.

 

Иммунный электрофорез

Принцип метода. Реакции антиген-антитело. Иммуноэлектрофорез в агаровых или агарозных гелях. Диффузия и преципитация в геле.

Иммунофиксация. Принцип метода. Оценка метода. Область применения.

Электросинерез (встречный электрофорез, электроиммуноосмофорез). Принцип метода. Оценка метода. Область применения.

Электроиммуноанализ (электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Принцип метода. Количественное определение антигенов. Модификации метода. Область применения. Оценка метода.

Перекрестный иммуноэлектрофорез (перекрестный электрофорез в системе - антиген-антитело). Принцип метода. Оценка метода. Область применения.

Способы усиления преципитации при электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе

Спектральные методы

Спектр электромагнитного излучения, его основные характеристики и способы их выражения (длина волны, частота, волновое число, поток излучения, интенсивность). Ультрафиолетовая, видимая и инфракрасная области спектра. Классификация спектроскопических методов.

Спектрофотометрический метод анализа. Сущность метода. Законы поглощения электромагнитного излучения и способы их выражения. Закон Бугера-Ламберта-Бера, его математическое выражение. Величины, характеризующие поглощение. Молярный коэффициент поглощения. Оптическая плотность. Оптимальный интервал измеряемых значений оптической плотности (кривая ошибок). Критерии соблюдения законов поглощения и оценка чувствительности фотометрической реакции. Построение калибровочного графика. Способы определения концентраций веществ. Дифференциальный метод. Спектрофотометрическое титрование. Использование спектрофотометрии в хроматографии. Фотоэлектроколориметры и спектрофотометры. Применение колориметрии и спектрофотометрии.

Флюориметрические методы анализа. Различные виды люминесценции и их классификация. Основные закономерности молекулярной фотолюминесценции. Независимость спектров люминесценции от длины волны возбуждающего света. Тушение люминесценции: температурное, концентрационное, тушение посторонними примесями. Практическое применение метода. Хемилюминисцентный анализ.

 

Методы меченых атомов

Радиоактивные изотопы, используемые в биологии. Измерение радиоактивности. Авторадиография: принцип метода, техника проведения авторадиографии, преимущества и недостатки. Сцинтилляционные счетчики излучения: принцип действия, сцинтилляторы. Счет радиоактивности на фильтрах. Введение радиоактивной метки в биологические препараты in vivo и in vitro. Радиоиммуноанализ.

123	Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: