 |
Материалы и оборудование. Ход работы. Работа 27. Учет ризосферной и корневой микрофлоры по Е. 3. Теппер. Задача исследования заключается в детальном описании микробного пейзажа, сформировавшегося в капиллярах педоскопа
|
|
|
|
Материалы и оборудование.
Стерильные предметные и покровные стекла, клей БФ-6, калька, вата, спиртовка, пинцет, садовый нож, карболовый эритрозин, 96%-ный этанол.
Ход работы
Соблюдая стерильность, клеем БФ-6 склеивают упрощенные капиллярные педоскопы вертикальным или горизонтальным направлением ячеек. На предметное стекло приклеивают тонкие полоски кальки на расстоянии, равном размеру ширины покровных стекол. Полоски кальки осторожно смазывают клеем и накладывают на них стерильные покровные стекла (рис. 18). Клей не должен выходить за пределы полоски кальки, внутрь ячейки, под покровное стекло. Готовые педоскопы закапывают в почву или вегетационные сосуды. Садовым ножом, предварительно простерилизованным, делают разрез в почве и в него вводят педоскоп так, чтобы капилляры располагались вертикально, т. е. в направлении движения почвенного раствора. Время экспозиции педоскопов в почве 1, 0—2, 5 мес. По окончании срока экспозиции педоскопы вынимают из почвы, наружную поверхность осторожно вытирают ватой и немедленно во избежание подсыхания микроскопируют пейзажи на изучение подвижных форм. Для более детального изучения микробных пейзажей педоскопы помещают в чашки Петри и фиксируют их парами 2%-ной осмиевой кислоты 2—4 мин либо парами 40%-ного формалина несколько секунд. Зафиксированные педоскопы окрашивают, погружая стекла в стаканы с 5%-ным карболовым эритрозином на 12—24 ч, промывают водой, подсушивают, микроскопируют.
Задача исследования заключается в детальном описании микробного пейзажа, сформировавшегося в капиллярах педоскопа. При микроскопировании отмечают характер микрофлоры, плотность обрастания, доминирующие формы, отношения, сложившиеся между членами микробного ценоза.
|
|
|
Работа 27. Учет ризосферной и корневой микрофлоры по Е. 3. Теппер
Зона почвы, прилегающая непосредственно к корням растений, получила название ризосферы. Микрофлора ризосферной зоны значительно богаче и разнообразнее, нежели микрофлора почвы. Микроорганизмы обладают положительным хемотаксисом в отношении корневых выделений растений. Отмершие клетки корней используются микроорганизмами в качестве питательного материала. В свою очередь микроорганизмы ризосферы осуществляют минерализацию органических веществ и снабжают корни растений усвояемыми формами минеральных элементов—азота, фосфора и др. Кроме того, микроорганизмы в процессе жизнедеятельности выделяют физиологически активные вещества типа витаминов и ауксинов, способствующие усилению корневого питания и активизации обменных процессов в растениях.
Экспериментально показано, что ризосферная микрофлора специфична для определенного вида растений. Это, очевидно, объясняется характером корневых выделений растений. Как правило, в ризосферной зоне преобладают неспороносные формы бактерий рода Рseиdотопаs, микобактерии, анаэробные фиксаторы азота и др.
По Е. Ф. Березовой, принято различать: корневую микрофлору—микроорганизмы, находящиеся непосредственно на поверхности корней и проникающие в ткани корня; прикорневую микрофлору — микроорганизмы, населяющие слой почвы 0, 5 см, непосредственно примыкающий к корням; микрофлору ризосферы—микроорганизмы, находящиеся в почве на расстоянии 1—2 см от корней.
Наибольшее значение для растений имеет корневая и прикорневая микрофлора.
Для выделения и качественно-количественного изучения ризосферной и корневой микрофлоры в последнее время широкое применение получил метод последовательных отмываний корней по Е. 3. Теппер.
|
|
|
Материалы и оборудование.
Монолит почвы с растением, пинцет, часовое стекло, ножницы, весы, разновесы, колбы объемом 250 мл, содержащие по 99 мл стерильной дистиллированной воды, крючки из проволоки, микропипетки, шпатели, лупа, микроскоп, чашки Петри, МПА или КАА, прибор для счета микробных колоний, стерильный кварцевый песок, колбы со стерильной дистиллированной водой, пробирки, пипетки на 10 и 1, 2 мл, микропипетки на 0, 1—0, 2 мл.
Ход работы
Растение выкапывают с монолитом почвы. Стерильным пинцетом корни растения осторожно освобождают от прилипшей к ним почвы. С корневой системы растения стерильными ножницами срезают кусочки молодых корней и отвешивают 1 г на часовом стекле. Пинцетом переносят навеску корней в первую колбу с 99 мл стерильной дистиллированной воды и взбалтывают содержимое колбы 2 мин. Стерильным металлическим крючком переносят корни во вторую колбу с 99 мл стерильной дистиллированной воды и вновь взбалтывают содержимое колбы 2 мин.. Затем корни переносят последовательно в колбы № 3, 4, 5, 6 и 7, отмывая их в каждой колбе по 2 мин. В воду колб № 6 и 7 предварительно перед стерилизацией вносят по 3—5 г хорошо промытого стерильного кварцевого песка. Песком отделяются микроорганизмы, находящиеся в тесном контакте с корнем.
Для качественно-количественного анализа ризосферной и корневой микрофлоры из каждой колбы стерильной микропипеткой высевают по 0, 05 мл отмывной воды на поверхность пластинки МПА или КАА в чашки Петри. Повторность высева 3—5-кратная. Соблюдая стерильность, каплю высеянной жидкости втирают шпателем в поверхность питательной среды. Для каждого разведения следует иметь отдельную пипетку и отдельный шпатель.
Засеянные чашки Петри помещают в термостат при температуре 28—30°С. Через 3—5 дней приступают к анализу колоний, развившихся на агаровых пластинках в чашках Петри.
Колонии микроорганизмов изучают при малом увеличении микроскопа (окуляр 10—15х, объектив 8—10х) и делают подробное описание. Из колоний приготовляют мазки и рассматривают их, пользуясь объективом МИ-90. На препаратах обращают внимание на морфологические особенности микроорганизмов и по возможности устанавливают родовой состав ризосферной и корневой микрофлоры.
|
|
|
Анализ результатов опыта показывает, что количество микроорганизмов по мере увеличения степени отмыва корней почти не убывает. Наоборот, в двух последних колбах (№ 6, 7) численность микроорганизмов возрастает по сравнению с их численностью в отмывах первых колб. В чашках Петри с посевом из отмывов первых колб встречаются крупные колонии бацилл. По мере увеличения степени отмыва число спороносных бактерий уменьшается, зато возрастает число мелких, точечных колоний бактерий рода Рsеиdотопаs и колоний микобактерий, окрашенных в желтый и оранжевый цвет.
В высеве жидкости из отмывов первых и последних колб на пластинках питательной среды часто вырастает слишком много колоний микроорганизмов, которые трудно поддаются счету. Поэтому для более точного количественного определения микроорганизмов ризосферной зоны суспензию отмыва в первой колбе дополнительно взбалтывают 5 мин и из нее готовят ряд разведений. Из разведений делают посевы на пластинки МПА или КАА в чашки Петри, как указано выше.
Для количественного учета микроорганизмов корневой зоны используют отмывы остальных шести колб. Содержимое этих колб сливают вместе, из полученной суспензии готовят ряд разведений и делают посевы из них на пластинки питательной среды в чашки Петри. Засеянные чашки Петри выдерживают в термостате 3—5 суток при температуре 28—30°С. По всем параллельным чашкам Петри для каждого разведения подсчитывают число развившихся колоний и вычисляют среднее количество колоний на чашку (см. выше).
Число колоний, полученное на чашку Петри, умножают на 20 (пересчет с 0, 05 мл на 1 мл), на степень разведения, на 600 (6 смывов по 100 мл) и получают количество микроорганизмов на 1 г корней.
|
|
|
