 |
Лабораторная работа № 6. Задание № 1.. Литература: И.А. Бакулов. Эпизоотология с микробиологией с.94 – 98.
|
|
|
|
Лабораторная работа № 6.
Тема: Постановка реакций связывания комплемента, преципитации и агглютинации.
Цель занятия: Изучение методики постановки реакций иммунитета.
Литература: И. А. Бакулов. Эпизоотология с микробиологией с. 94 – 98.
Задание № 1. Изучить методику постановки реакции преципитации. Оценка результатов
реакции.
Задание № 2. Изучить методику постановки реакции агглютинации. Оценка результатов
реакции.
Задание № 3. Изучить методику постановки реакции связывания комплемента. Оценка
результатов реакции.
Методика выполнения:
Задание № 1.
Реакция преципитации (РП). Исследуют робы кожи на сибирскую язву. Пробы предварительно простерилизованы в автоклаве.
К о м п о н е н т ы р е а к ц и и: кусочек кожи измельчают. 1 г полученной массы помещают в пробирку, заливают 10 мл физраствора и 30 – 40 мин кипятят в водяной бане ( горячий способ постановки реакции ). Другой вариант: 1 г измельченной кожи растирают в ступке с песком, заливают 0, 3 %- ным карболизированным физраствором ( 1: 10 ) и 16 – 18 ч настаивают при комнатной температуре ( холодный способ ). Экстракт, который может содержать сибиреязвенный антиген ( преципитиноген ), фильтруют через асбестовую вату до полной прозрачности. Второй компонет – биофабричная преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Перед постановкой реакции ее фильтруют.
П о с т н о в к а р е а к ц и и. Мерной пипеткой наливают в специальные преципитационные пробирки по 0, 2 – 0, 3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой осторожно по стенке пробирки наслаивают на сыворотку исследуемый экстракт в таком же количестве (метод наслаивания). При использовании метода подслаивания в пробирки наливают исследуемый экстракт, а затем, опустив пастеровскую пипетку на дно пробирки, подслаивают под нее преципитирующую сыворотку.
|
|
|
Реакция считается положительной, если в течение первых 15 мин с момента ее постановки на границе соприкосновения экстракта и сыворотки образуется серовато-белое кольцо. Если это кольцо недостаточно резко выражено, реакцию оценивают как сомнительную, а при отсутствии кольца – как отрицательную.
Непосредственно перед постановкой реакции ставят контроли с ее компонентами: 1) сибиреязвенный антиген (биофабричный) + преципитирующая сыворотка – реакция должна быть положительной; 2) сибиреязвенный антиген + нормальная сыворотка лошади – реакция должна быть отрицательной; 3) физраствор + преципитирующая сыворотка – реакция должна быть отрицательной.
Задание № 2.
Р е а к ц и я а г г л ю т и н а ц и и (РА). Исследуют сыворотки крови животных на бруцеллез.
К о м п о н е н т ы р е а к ц и и: пробы сывороток крови, единый бруцеллезный антиген для роз бенгал пробы, позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки, фенолизированный (0, 5%-ный) физраствор.
Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным розбенгал антигеном (РБП). Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18 – 30*С. С помощью шприца-полуавтомата или микропипетки вносят на дно лунок до 0, 03мл исследуемых сывороток. Затем в каждую лунку добавляют по 0. 03мл цветного антигена. При исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов и северных оленей достаточно 0, 015мл антигена. Антиген и сыворотки тщательно смешивают, распределяя полученную смесь по всей поверхности лунки. Пластинку осторожно покачивают. Реакцию учитывают в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном. При наличии выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена, проявляющейся образованием розовых хлопьев, реакцию считают положительной, а при отсутствии агглютинации (смесь остается равномерно окрашенной) – отрицательной. Если кровь была доставлена из благополучных хозяйств, все сыворотки с положительной РБП не позже чем на следующий день исследуют в РА и РСК. Окончательная диагностическая оценка сомнительна только при положительной РБП и отрицательных РА и РСК. В остальных случаях она положительная. По аналогичной схеме оценивают результаты исследований сывороток крови КРС, буйволов, лошадей и верблюдов из неблагополучных хозяйств. Но овец, коз, свиней и северных оленей из таких хозяйств признают больными бруцеллезом при положительных результатах РБП без дополнительных исследований.
|
|
|
Перед постановкой РБП ставят контроль антигена с негативной и позитивной бруцеллезными сыворотками и контроль антигена на спонтанную агглютинацию: к 0, 03мл антигена добавляют 0, 03мл физраствора.
Классический (пробирочный) метод РА. Реакцию с сыворотками крови КРС проводят в объеме 1 мл в разведениях 1: 50, 1: 100, 1: 200 и 1: 400. Контроли: с негативной сывороткой в тех же разведениях и с позитивной бруцеллезной сывороткой до ёё предельного титра.
Для исследования каждой сыворотки требуется 5 пробирок. В первую из них вносят 0, 1 мл сыворотки и добавляют 2, 4 мл физраствора (основное разведение 1: 25). В третью, четвёртую и пятую пробирки вливают по 0, 5 мл физраствора. Затем из первой пробирки переносят во второю и третью по 0, 5 мл основного разведения сыворотки. После смешивания 0, 5 мл содержимого третьей пробирки переносят в четвертую и так же – из четвертой в пятую, после чего из пятой пробирки удаляют 0, 5 мл полученной смеси. Затем во вторую, третью, четвёртую и пятую пробирки добавляют по 0, 5 мл антигена, разбавленного физраствором в соотношении 1: 10. Так получают требуемые разведения сыворотки. В первую пробирку антиген не вносят (контроль качества сыворотки). Сыворотки разливают микропипеткой (с грушей), а при массовых исследованиях – групповыми дозаторами Флорентийского.
Штатив с пробирками осторожно встряхивают, помещают на 16 – 20 ч в термостат при 37 –38*С, затем в течение 1 ч выдерживают при комнатной температуре и проводят учёт реакции.
|
|
|
Учёт начинают с контроля. Ход реакции нормален, если в контроле с негативной сывороткой получен отрицательный результат, а с позитивной бруцеллёзной сывороткой – положительный. Результаты определяют в крестах. Четыре креста (++++) – полное просветление жидкости и наличие ясно выраженного осадка в виде зонтика. При встряхивании пробирки зонтик разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остаётся прозрачной (100% агглютинации). Три креста (+++ )-неполное просветвление жидкости и хорошо выраженный зонтик (75% агглютинации). Два крета (++) – слабое просветвление жидкости и умеренно выраженный зонтик (50% агглютинации). Один крест (+) – едва заметное просветвление жидкости, зонтик выражен слабо (25% агглютинации). Минус (-) - просветвления жидкости нет, зонтик не образовался, на дне пробирки виден осадок в виде точки, при лёгком встряхивании пробирки образуется равномерная взвесь.
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на два креста. У КРС бруцеллёз считают установленным при положительной РА в титре 1: 200 и выше, т. е. при наличии в 1 мл сыворотки не менее 200 МЕ антител.
|
|
|
