 |
Задание № 3. Задание №1 РП. Задание №2 РА.. Задание №3 РСК (общая схема)
|
|
|
|
Задание № 3.
Реакция связывания комплемента ( РСК ). С у щ н о с т ь р е а к ц и и. При добавлении к сыворотке, содержащей определённые антитела (в нашем примере – бруцеллёзные), соответствующего антигена, а затем комплемента происходит соединение этих трех компонентов (бактериологическая система). Факт указанного соединения выявляют при внесении в бактериолитическую систему второй, гемолитической системы, состоящей из гемолизина и эритроцитов барана. При отсутствии в исследуемой сыворотке антител к применённому в реакции антигену про изойдёт гемолиз эритроцитов, так как комплемент, не связавшийся в первой системе, соединится с гемолизином во второй, гемолитической системе.
К о м п о н е н т ы р е а к ц и и: испытуемая и контрольные (негативная и позитивная бруцеллезная) сыворотки крови КРС; антиген бруцеллезный, единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном предприятием-изготовителем; комплемент – свежая, консервированная или сухая сыворотка крови морской свинки; гемолитическая сыворотка (гемолизин) в удвоенном титре, указанном изготовителем; эритроциты барана – 2, 5%-ная (от осадка) взвесь в физрастворе; физраствор. В день постановки реакции испытуемую и контрольные сыворотки инактивируют в водяной бане при 60 – 62*С в течение 30мин.
Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в гемолитической и бактериологической системах. Периодически (один раз в 3 месяца и каждую новую серию) титрируют и гемолизин.
Титрование гемолизина. В начале готовят основное разведение гемолизина – 1: 100 (0, 1мл гемолизина + 9, 9мл физраствора). Затем из основного готовят разведения 1: 500; 1: 1000 и т. д. до 1: 4000 по следующей схеме:
|
|
|
Основное разведение Физиологический Получаемое
гемолизина 1: 100мл раствор, мл разведение
0, 4 1, 6 1: 500
0, 1 0, 9 1: 1000
0, 1 1, 4 1: 1500
0, 1 1, 9 1: 2000
0, 1 2, 4 1: 2500
0, 1 2, 9 1: 3000
0, 1 3, 4 1: 3500
0, 1 3, 9 1: 4000
В пробирки вносят по 0, 2мл каждого разведения гемолизина и добавляют по 0, 2мл комплемента в разведении 1: 20, по 0, 2мл 2, 5%-ной взвеси эритроцитов, по 0, 4мл физраствора. Пробирки встряхивают, ставят в водяную баню при 37 – 38*С на 10 мин и затем учитывают результат. Титр гемолизина – его наименьшее количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 мин 0, 2мл взвеси эритроцитов в присутствии 0, 2мл комплемента, разведенного 1: 20. Рабочий титр должен быть в 2 раза выше.
Титрование комплемента в гемолитической системе. Комплемент в разведении 1: 20 разливают в пробирки в дозах от 0, 02 до 0, 2мл с интервалами по 0, 02мл. В каждую пробирку добавляют физраствор до объема 0, 2мл. Затем во все пробирки вносят по 0, 2мл гемолизина в удвоенном титре и по 0. 2мл 2, 5%-ной взвеси эритроцитов. Следующий этап – добавление физраствора по 0, 4мл. После встряхивания пробирки на 10 мин помещают в водяную баню при з7 – 38*с и учитывают результат. Титр комплемента – его наименьшее количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов.
|
|
|
Титрование комплемента в бактериолитической системе. Оно позволяет окончательно определить дозу комплемента для системы с испытуемой сывороткой и антигеном. Используют инактивированные позитивную бруцеллезную и негативную сыворотки. Их разводят физраствором 1: 5 и разливают по 0, 2мл: каждую в два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент, разведенный 1: 20, в возрастающих дозах: от 0, 02 до 0, 2мл с интервалом 0, 02мл. Недостающее по 0, 2мл содержимое пробирок дополняют физраствором. После розлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0, 2мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд – по 0, 2мл физраствора. Пробирки встряхивают и на 20 мин ставят в водяную баню. Затем во все пробирки добавляют по 0, 4мл гемолитической системы (0, 2мл гемолизина в рабочем титре и 0, 2мл 2, 5%-ной взвеси эритроцитов) и вновь ставят на 20 мин в водяную баню при 37 – 38*С. После этого учитывают результат. Титр комплемента в бактериолитической системе – его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз взвеси эритроцитов в пробирках с негативной сывороткой с антигеном и без него, а также в пробирках с позитивной сывороткой без антигена при задержке гемолиза в пробирках с позитивной сывороткой с антигеном.
Проведение главного опыта. Испытуемую сыворотку исследуют в разведениях 1: 5 и 1: 10 с антигеном и 1: 5 без антигена (контроль). Реакцию проводят в объеме 1 мл – каждый компонент берут в объеме 0, 2 мл в установленном рабочем титре (разведении). Контроли главного опыта: негативная и позитивная бруцеллёзная сыворотки в разведениях 1: 5 и 1: 10 с антигеном и 1: 5 без антигена; гемолитическая система (гемолизин и эритроциты по 0, 2 мл и 0, 6 мл физраствора).
|
|
|
После розлива компонентов бактериолитической системы (сыворотка +антиген+комплемент) пробирки в течение 20 мин выдерживают в водяной бане. Затем разливают компоненты гемолитической системы и вновь на 20 мин помещают пробирки в водяную баню. Результаты реакции учитывают через 3 – 4 ч после извлечения штативов из водяной бани и оценивают в крестах: ++++ - отсутствие гемолиза; +++ - гемолиз 25% эритроцитов; ++ - гемолиз 50% эритроцитов; + - гемолиз 75% эритроцитов; - (минус) – полный гемолиз эритроцитов, отсутствие осадка, интенсивное окрашивание жидкости гемоглобином. Реакцию признают положительной при задержке гемолиза на 2 – 4 креста в одном или двух разведениях испытуемой сыворотки и сомнительной – при задержке гемолиза с оценкой в один крест. При получении сомнительного результата сыворотки крови от соответствующих животных через 15 – 30 дней исследуют повторно. Если сомнительная РСК получена дважды, животных считают положительно реагирующими.
Отчёт
Задание №1 РП.
| Постановка реакции (в рисунке) | Учёт реакции |
|
| |
Задание №2 РА.
| Постановка реакции (в рисунке) | Учёт реакции |
|
| |
Задание №3 РСК (общая схема)
| Компоненты и этапы постановки РСК | Больное животное | Здоровое животное |
| Бактериометрическая система | ||
|
| ||
| Геометрическая система | ||
|
| ||
| Результат | ||
| Заключение | ||
|
| ||
|
|
|
