Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!

Определение белка на ФЭКе.

Принцип: интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации.

Реактивы :
1. 3%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.
2. 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

3. Стандартный раствор альбумина — 1%-ный раствор (1 мл раствора, содержащий 10 мг альбумина): 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9%-ного раствора хлорида натрия в колбе вместимостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же раствором.

Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5%-ного раствора азида натрия (NaN3). При хранении в холодильнике реактив годен в течение 2 месяцев.
Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр.

Ход определения:

В градуированную центрифужную пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты, перемешивают.

Через 5 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590—650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете длиной оптического пути 5 мм.

Контролем служит пробирка, в которой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до 5 мл 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого из стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице.

N пробирки	Стандартный раствор (мл)	0,9% раствор хлорида натрия (мл)	Концентрация белка (г/л)
	0,05	9,95	0,05
		9,9	0,1
	0,2	9,8	0,2
	0,5	9,5	0,5
	1,0	9,0	1,0

Из каждого полученного раствора берут 1,25 мл и обрабатывают, как опытные пробы.
Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях пробу следует разводить и учитывать разведение при расчете.

Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче контрастных веществ, содержащих органический йод. Поэтому тест нельзя использовать у лиц, принимающих препараты йода; ложноположительный результат может быть также обусловлен приемом сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и при высоких концентрациях в моче мочевой кислоты.

Обнаружение в моче белка Бенс-Джонса
Белки Бенс-Джонса — термочувствительные микромолекулярные парапротеины, свертывающиеся при относительно низкой температуре (40-60°С), а при кипячении вновь растворяющиеся.

Принцип метода основан на обнаружении в моче белка при t 45-55°C.

Ход определения. К 10 мл мочи добавляют 3-4 капли 10% уксусной кислоты (рН 5-6) и 2 мл насыщенного раствора поваренной соли (NaCL). Осторожно нагревают на водяной бане. При наличии в моче парапротеинов при t 45-55°C появляется диффузное помутнение, которое усиливается при повышении температуры (t 66-72°C) и сопровождается появлением больших хлопьев, осаждающихся на дно пробирки. При повышении температуры до 80-100 °С осадок растворяется.

При обычной протеинурии помутнение (образование хлопьев) наступает при температуре выше 55°С, образование осадка - при кипячении выше температуры 55°С, увеличение осадка - при t кипения 90-100°С.

Самостоятельная работа с исследовательским этапом

Методические установки:

ü прочитать и законспектировать методы определения белка в моче в рабочих тетрадях;

ü затем получить у преподавателя образцы биологического материала;

ü провести самостоятельную исследовательскую работу пользуясь методическим материалом;

ü полученные результаты исследования оформить согласно требованиям заполнения бланков анализа.

Задание №1. Качественное определение белка в моче пробой с 20% раствором сульфосалициловой кислоты (C₇H₆O₆S)

Примечание:Моча должна быть прозрачной и иметь кислую рН. Если моча имеет щелочную реакцию, ее подкисляют 10% раствором уксусной кислоты до слабокислой реакции

Посуда, оборудование и реактивы:

· химические и центрифужные пробирки · штативы для пробирок · градуированные пипетки · пастеровские пипетки · резиновые груши · черный фон · 20% раствор сульфосалициловой кислоты

Ход исследования:

В 2 пробирки одинакового диаметра наливают по 2 мл отфильтрованной мочи кислой реакции. Одна пробирка – опытная, вторая – контрольная. В опытную пробирку добавляют 2 капли 20% раствора сульфосалициловой кислоты.

Интерпретация полученных результатов:

Опытную пробирку сравнивают с контрольной на черном фоне. Наличие помутнения – положительная реакция. Необходимо подогреть пробирку – если истинный белок, муть усилится, если ложный (соли, слизь) – исчезнет.

Задание №2. Качественное определение белка в моче пробой Геллера

Посуда, оборудование, реактивы

· химические и центрифужные пробирки · штативы для пробирок · градуированные пипетки на 1 мл · резиновые груши · черный фон · 50% раствор азотной кислоты (НNO₃) · реактив Ларионовой · секундомер

Ход определения:

1.В пробирку наливают 1 мл реактива Ларионовой 2.Затем осторожно по стенке наслаивают 1 мл мочи Соотношение всегда 1:1 Жидкости не должны смешиваться!!!

Интерпретация полученных результатов:

Пробу оставляют на 3 мин. Через 3 мин. Отсчитывают результат реакции. При положительной реакции на белок на границе мочи и кислоты (или реактива) образуется белое непрозрачное кольцо. Реакцию оценивают на темном фоне, в проходящем свете.

Задание №3. Определение белка в моче с помощью тест-полосок

Для выявления протеинурий используют различные монотест – полоски: Альбуфан, Альбустикс, Биофан и политесты: Трискан, Нонафан и др. Определение производят, ориентируясь на конкретную инструкцию

Посуда, оборудование, реактивы

· тест-полоски Альбуфан

Ход определения:

Тест-полоску погружают в исследуемую мочу так, что бы одновременно смочить обе индикаторные зоны.

Интерпретация полученных результатов:

Оценку содержания белка проводят через 60 с после смачивания полоски мочой, пользуясь цветной шкалой.

Задание №4. Запишите полученные данные анализа мочи на белок в рабочих тетрадях

Проба мочи № ___

Показатели	Результат
Количество доставленной мочи на анализ	Диагностического значения не имеет
Цвет мочи	Различные оттенки жёлтого цвета
Прозрачность мочи	Прозрачная
Запах мочи	Специфический
Реакция мочи или рН	Слабо-кислая
Удельный вес (относительная плотность) мочи	1,026
Белок в моче	«+» или отсутствует

Задание №5. Количественное определение белка в моче пробой Брандберга-Робертса-Стольникова

Посуда, оборудование, реактивы

Ход определения:

1.В пробирку наливают 1 мл реактива Ларионовой 2.Затем осторожно по стенке наслаивают 1 мл мочи Соотношение всегда 1:1 Жидкости не должны смешиваться!!! 3.Сразу включают секундомер 4.Засекают время появления белого кольца и его толщину

Интерпретация полученных результатов:

Реакцию оценивают на темном фоне, в проходящем свете. Если кольцо появляется раньше 1 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т. е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся раньше 1 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком – в 4 раза, при компактном – в 8 раз. Разведение мочи делают в мерной центрифужной пробирке, наливая мочу до метки 1 мл и доливают водой до той метки, во сколько раз делается разведение. Содержимое пробирки тщательно перемешивают пастеровской пипеткой с баллоном. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на литр (г/л). Подбирают такое разведение мочи, чтобы при наслаивании ее на азотную кислоту нитевидное кольцо появилось на 2 – 3-й минуте.

Задание №6. Количественное определение белка в моче на ФЭКе

Посуда, оборудование, реактивы

· градуированные центрифужные пробирки · штативы для пробирок · градуированные пипетки на 1 мл · резиновые груши · 3% раствор сульфосалициловой кислоты · 0,9%-ный раствор хлорида натрия · ФЭК (фотоэлектроколориметр) · кювета 5 мм

Ход определения:

В градуированную центрифужную пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин измеряют на фотоэлектроколориметре (красный светофильтр) против контроля в кювете длиной оптического пути 5 мм. Контролем служит пробирка, в которой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до 5 мл 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

Интерпретация полученных результатов:

Расчет ведут по калибровочному графику, учитывая показания экстинции.

Задание №7. Запишите полученные данные анализа мочи на белок в рабочих тетрадях

Проба мочи № ___

Показатели	Результат
Количество доставленной мочи на анализ	Диагностического значения не имеет
Цвет мочи	Различные оттенки жёлтого цвета
Прозрачность мочи	Мутноватая
Запах мочи	Аммиака
Реакция мочи или рН	Щелочная
Удельный вес (относительная плотность) мочи	1,032
Белок в моче	0,25гл

В нормальной моче белок содержится в минимальных количествах, которые не обнаруживаются обычными качественными реакциями. Верхняя граница нормы – 0,033 г/л. Протеинурия (альбуминурия) – появление белка в моче выше 0,033 г/л, при которых лабораторные пробы на белок становятся положительными.

Контрольные вопросы и задания

А. Ответьте на поставленные вопросы, используя рабочую тетрадь

1. Как называется появление белка в моче?

2. Какие виды ренальных протеинурий Вы знаете?

3. Значение анализа на белок мочи в медицине для диагностики и контроля над лечением больных?

4. Назовите классификацию протеинурий.

5. Назовите причины внепочечных протеинурий.

6. Что такое белок Бенс-Джонса?

7. Как определяют рН мочи?

8. Требования к моче для определения белка?

9. Как приготовить реактив Ларионовой?

10. На каких свойствах белка основаны методы его определения?

11. Как развести мочу в 8 раз?

12. Как определить истинный белок или нет?

13. Почему моча для определения белка должна быть кислой реакции?

14. Назовите причины физиологических протеинурий.

15. Расскажите методику обнаружения белка в моче с 20% сульфосалициловой кислотой.

16. Клиническое значение определения белка в моче.

17. Принципы использования тест – полосок, их преимущества, классификация, ход исследования, основные правила.

18. На стол пролита концентрированная азотная кислота. Ваша тактика?

19. Раствор азотной кислоты попал Вам на кожу. Ваши действия?

20. Как приготовить 300 мл 20% сульфосалициловой кислоты

(по навеске)?

21. Рассчитайте количество белка в исследуемой моче, если:

Задание 1. Мочу развели в 5 раз

Задание 2. Мочу первоначально развели в 10 раз, а затем

разведенную в 10 раз мочу развели еще в 3 раза.

Б.Запишите в рабочей тетради термины и дайте им обозначение, используя изученный материал

№ Термин Обозначение

Протеинурия появление белка в моче

Пиелонефрит неспецифическое инфекционно-воспалительное заболевание почек с преимущественным поражением чашечно-лоханочной системы и канальцев

Гломерулонефрит

Миеломная болезнь

Альбумин простой, растворимый в воде белок крови, не содержащий углеводов, составляющий примерно половину всех сывороточных белков

Бенс-Джонса протеинурия

Цистит

Реабсорбция активное поглощение различных веществ из первичной мочи обратно в кровь

Коагуляция

Тубулопатия группа заболеваний, характеризующихся нарушением работы почечных канальцев

Домашнее задание:

1. Знать теоретический и практический материал.

2. Отвечать на контрольные вопросы.

3. Знать термины.

4. Подготовить лекционный материал:

- причины и виды протеинурий.

Литература для самостоятельной подготовки:

Основная:

Камышников В.С. Методы клинических лабораторных исследований М: МЕДпресс-информ, 2011. Стр. 37-41

Дополнительная:

· Кишкун А.А. Клиническая лабораторная диагностика. – М.: ГЭОТАР – Медиа, 2008.

1 23
Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: