 |
Определение антимикробной активности антибиотиков. Условия ферментации антибиотиков. Рост биомассы АБ. Предшественники АБ.
|
|
|
|
Определение антимикробной активности АБ.
Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест - микробов,образующихся при испытании растворов определенных концентраций.Государственного стандартного образца <*> и испытуемого препарата.Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия - ЕД или "мгк". Для большинства антибиотиков 1 ЕД или "мкг" соответствуют 1 мкг активного вещества (кислоты или основания); для антибиотиков, имеющих иное количественное выражение единицы, соответствующие указания даются в частных статьях. При определении антимикробной активности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило,устанавливают в соответствии с Международными биологическим стандартами. При отсутствии последних для указанных целей могут быть использованы международные химические стандарты, антимикробную активность которых рассчитывают на основании показателей качества, установленных физико - химическими методами.Антимикробную активность стандартных образцов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной коллекции стандартов,рассчитывают также на основании показателей качества,установленных физико - химическими методами.Метод определения. Тест - микробы, растворители, буферные растворы, питательные среды и прочие условия проведения испытания Указаны. В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разливают расплавленные питательные среды определенного состава в один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные среды, для верхнего или одного слоя - агаровую среду, предварительно засеянную соответствующим тест - микробом. Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высотой (10,0 +/-0,1) мм и внутренним диаметром (6,0 +/-0,1) мм, из нержавеющей стали или алюминия расставляют на поверхности засеянной среды на равном расстоянии друг от друга и от края чашки.В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов.Диаметры зон угнетения роста тест - микроба при помощи соответствующих приборов измеряют с точностью до 0,1 мм.
|
|
|
Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием трехдозного варианта метода диффузии в агар. Для проведения испытания готовят три раствора стандартного образца(C1, С2, С3) и три раствора испытуемого образца (И1, И2, И3).Все растворы стандартного и испытуемого образцов вносят в цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы с большими концентрациями не соприкасались между собой.Расчет активности и дисперсионный анализ при использовании трехдозного варианта метода диффузии в агар осуществляется в соответствии со статьей "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний".
Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием стандартной кривой. Постановка опыта. В день постановки анализа из основного раствора готовят пять рабочих растворов стандартного образца C1, С2, С3, С4, C5 с концентрациями, увеличивающимися в геометрической прогрессии (Z), обычно в соотношении 1:1,25. Средняя концентрация (С3) является контрольной. Раствор контрольной концентрации С3 закапывают в три цилиндра (или лунки) каждой из взятых в опыт чашек, в три другие цилиндра (лунки) закапывают раствор одной из концентраций стандартного образца, чередуя его с раствором контрольной концентрации. Таким образом, для построения стандартной кривой используют 12 чашек. После инкубации в термостате измеряют диаметры зон угнетенияроста тест - микробов. Далее вычисляют среднюю величину диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца в каждой группе из трех чашек, затем среднюю величину диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца из всех 12 чашек (общую среднюю из 36 зон). По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 12 чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней величине диаметра зоны данной концентрации,если она положительная, и вычитают, если она отрицательная.
|
|
|
Условия ферментацииАБ.
-использование простых или комплексных сред в зависимости от АБ. Среды богаты многокомпонентными питательным веществами.
-в среде не должно быть глюкозы (нельзя использовать легко усвояемые источники углеводов), используют трудно усвояемые источники углеводов –например, крахмал. Не является репрессором биосинтеза и лактоза,которая трудно утилизируется.
- в качестве источника аммонийного азота используют соевую муку;Аммоний и другие легкоутилизируемые источники азотакак и легкоокисляемые углеводы усиливают рост продуцентов АБ,но отрицательно влияют на их биосинтез. Соевая и хлопковая мука,БВК(белково-витаминный концентрат) медленно расщепляются в процессе ферментации,т.е из ни медленно высвобождаются аминокислоты и ионы аммония,это способствует высокому выходу АБ.
- должна быть небольшая концентрация фосфора.Высокое содержание фосфора способствует обогощению клеток макроэргическими фосфорными соединениями,что повышает скорость роста мицелия.Накапливается много биомассы,но мало АБ.
-Кислород необходим для синтеза большинства АБ,тк он расходуется на замыкание беталактамного и тиазолидинового колец во время биосинтеза беталактамнойстуктуры.В целом потребность в кислороде зависит от концентрации биомассы и её метаболической активности. Оптимизация снабжения кислородом достигается увелечением скорости его переноса.
|
|
|
Любые предшественники для получения антибиотической структуры надо
добавлять не в «0» точке ферментации, а на 2-е, 3-и сутки (если продуцент –
грибы или актиномицеты), когда антибиотики начинают синтезироваться (это
относится, например, и к фенилуксусной кислоте (ФУК) при синтезе
пенициллина, которую добавляют на вторые или третьи сутки биосинтеза
пенициллина).
Рост биомассы АБ.
Предшественники АБ.
β-лактамные антибиотики синтезируются из аминокислот L-цистеин, L -валин, L -аминоадипиновая кислота, из которых синтезируется LLD-трипептид (L –валин превращается в D-валин). Из линейного LLD-трипептидаобразуетсялактамное кольцо, затем образуется пятичленное серосодержащеекольцо и т.д. Антибиотики не являются продуктом матричного синтеза.
Аминогликозиды синтезируются из глюкозы.Тетрациклины и макролиды синтезируются с помощью ацетилкоэнзимаА(Ац-КоА) наподобие жирных кислот (с участием приблизительно 22-х
ферментов).Ферменты синтезирующие антибиотики образуют мультиферментные
комплексы (за счет водородных связей), в которые «входят»предшественники антибиотика, а «выходит» целая молекула антибиотика (вовнешнюю среду). Эти комплексы располагаются по периферии клеткипродуцента. Таким образом, антибиотики отделяются от других систем
синтеза в клетке, и антибиотик никак не воздействует насвой продуцент (не ингибирует и не активирует другие процессы). К тому же мембраныпродуцента непроницаемы для вышедшего продуцента, тем самым создаваяусловия одностороннего движения антибиотика только во внешнюю среду.
7. Механизмы защиты продуцентов от антибиотиков. Ретроингибирование антибиотиков. Механизмы развития резистентности у бактерий к антибиотикам. Антибиотики резерва (ванкомицин, тейкопламин, ристомицин). Антибиотики с ингибиторами беталактамаз микроорганизмов. Пенициллинсвязывающие белки (ПБС-2, ПБС-3).
Механизмы защиты продуцентов от антибиотиков.
Ретроингибирование – это ингибирование синтеза по механизму обратной связи.
Очень важно бороться с ретроингибированием.
|
|
|
